實(shí)時(shí)熒光定量PCR??！
發(fā)布人：admin
瀏覽次數：1062
發(fā)布時(shí)間：2017-11-02
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應用。本文試就其定量原理、方法及參照問(wèn)題作一介紹。
一. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理
所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標準曲線(xiàn)對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。
1. Ct 值的定義
在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個(gè)很重要的概念 —— Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個(gè)反應管內的熒光信號到達設定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數
2. 熒光域值（threshold）的設定
PCR反應的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15
3. Ct值與起始模板的關(guān)系
研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線(xiàn)性關(guān)系〔1〕，起始拷貝數越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線(xiàn)，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線(xiàn)上計算出該樣品的起始拷貝數。
4. 熒光化學(xué)
熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料〔2〕?，F將其原理簡(jiǎn)述如下：
1）TaqMan熒光探針：
PCR擴增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個(gè)報告熒光基團和一個(gè)淬滅熒光基團。探針完整時(shí)，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時(shí)，Taq酶的 5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。
2）SYBR熒光染料：
在PCR反應體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì )發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。（轉帖）
