PCR擴增產(chǎn)物的克隆2
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發(fā)布時(shí)間：2017-11-29
實(shí)驗材料 模板DNA
試劑、試劑盒 SauIKlenow片段T4連接酶
儀器、耗材 移液器移液器吸頭PCR小管DNA擴增儀電泳槽電泳儀臺式高速離心機
實(shí)驗步驟
一、PCR反應
1. 依次混勻下列試劑
（1）H2O：35 μl
（2）10×PCR反應緩沖液：5 μl
（3）25 mmol/L MgCl2：4 μl
（4） 4種dNTP：4 μl
（5）上游引物（引物1）：0.5 μl
（6）下游引物（引物2）：0.5 μl
（7）模板DNA（約1 ng）：0.5 μl
（8）混勻后離心5秒。
2. 將混合物在94℃下加熱5分鐘后冰冷，迅速離心數秒， 使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶（0.5 μl約2.5 U），混勻后稍離心，加入一滴礦物油覆蓋于反應混合物上。
3. 用94℃變性1分鐘，45℃退火1分鐘， 72℃延伸2分鐘， 循環(huán)35輪，進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結束后， 于72℃下保溫10分鐘，使反應產(chǎn)物擴增充分。
二、電泳
取10 μl擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，檢查反應產(chǎn)物及長(cháng)度。
三、PCR產(chǎn)物的純化
擴增的PCR產(chǎn)物如利用T-Vector進(jìn)行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產(chǎn)物純化。
1. 酚/氯仿法
（1）取反應產(chǎn)物加100 μl TE。
（2）加等體積氯仿混勻后用微型離心機10000 rpm離心15秒，用移液器將上層水相吸至新的小管中。這樣抽提一次， 可除去覆蓋在表面的礦物油。
（3）再用酚:氯仿:異戊醇抽提二次，每次回收上層水相。
（4）在水相中加300 μl 95％乙醇，置-20℃下30 min沉淀。
（5）在小離心機上10000 rpm離心10 min，吸凈上清液。加入1 ml 70％乙醇，稍離后，吸凈上清液.重復洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7 ml ddH2O 中，待用。
2. Wizard PCR DNA純化系統
Wizard PCR DNA純化系統可以快速、有效、可靠地提取PCR擴增液中的DNA，提純后的DNA可用于測序、標記、克隆等。 該系統中含有的試劑和柱子可供50次PCR產(chǎn)物的純化，試劑包括：50 ml Wizard PCR DNA純化樹(shù) 脂、5 ml 直接提取緩沖液、50支 Wizard微型柱。
（1）吸取PCR反應液水相放于1.5 ml eppendorf管中。
（2）加100 ml直接提取緩沖液，渦旋混勻。
（3）加1 ml PCR DNA純化樹(shù)脂，1分鐘內渦旋混合3次。
（4）取一次性注射器， 取出注塞，并使注射筒與Wizard微型柱連接，用移液槍將上述混合液加入注射筒中，并用注塞輕推，使混合物進(jìn)入微型柱。
（5）將注射器與微型柱分開(kāi)，取出注塞， 再將注射筒與微型柱相連，加入2 ml 80%異丙醇，對微型柱進(jìn)行清洗。
（6）取出微型柱置于eppendorf管中，12 000 g離心20秒，以除去微型柱中的洗液。
（7）將微型柱放在一個(gè)新eppendorf管中，加50 μl TE或水，靜止1分鐘后，12 000 g離心20秒。
（8）丟棄微型柱，eppendorf管中的溶液即為純化DNA，存放于4℃或-20℃。
四、載體加dT尾
1. 將1 μg pUC19用SmaⅠ全酶切。
2. 在小管中按上述PCR反應，加入各種混合物，除將4 μl 4種dNTP改為4 μl 25 mM dTTP。
3. 加入1 μl(5U)的Taq DNA聚合酶在72℃下加熱2 h。
4. 按前面三中所述，用酚:氯仿:異戊醇抽提二次。
5. 加入2倍體積 95％乙醇，在-20℃下沉淀1 h。
6、離心，用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于10ml ddH2O中。
五、PCR產(chǎn)物與載體粘末端連接
1. 在7 ml PCR產(chǎn)物中加1 ml帶dT尾的pUC質(zhì)粒。
2. 加1 ml T4DNA連接酶，1 ml 10×連接緩中液，混勻，16℃連接過(guò)夜。
3. 取5 ml連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞并篩選重組子。
六、PCR產(chǎn)物3'突出端切平及平末端連接
1. 在50 ml的PCR產(chǎn)物中，直接加0.5 ml T4 DNA聚合酶混勻。
2. 37℃反應10分鐘后，70℃滅活10分鐘。
3. 用酚:氯仿抽提2次。
4. 乙醇沉淀。沉淀用70%乙醇漂洗后，真空抽干，溶于7 ml ddH2O中。
5. 質(zhì)粒用Smal 切開(kāi)后，70℃ 15分鐘滅活酶，取1 ml （約0.1 mg）加入上述PCR產(chǎn)物中。加T4 DNA連接酶1 ml ，連接緩沖液1 ml 。
6. 取5 ml 連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)細胞并篩選重組子。
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