免疫熒光細胞化學(xué)染色方法  

一、標本制作  可制作涂片、印片、細胞單層培養物、組織切片，經(jīng)適當固定或不固定，作免疫熒光染色用。  

二、熒光抗體染色方法

? 直接法  

1．染色 切片經(jīng)固定后，滴加經(jīng)稀釋至染色效價(jià)如1：8或1：16的熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體或兔抗人IgG或IgA熒光抗體等），在室溫或37℃染色30min，切片置入能保持潮濕的染色盒內，防止干燥。  

2．洗片  傾去存留的熒光抗體，將切片浸入pH7.4或pH7.2PBS中洗兩次，攪拌，每次5min，再用蒸餾水洗1min，除去鹽結晶。

3．用50%緩沖（0.5mol/L碳酸鹽緩沖液pH9.0～9.5）甘油封固、鏡檢

4．對照染色  

①正常免熒光血清染色，如上法處理切片，結果應為陰性。

②染色抑制試驗（一步法）：將熒光抗體和未標記的抗體球蛋白或血清（相同）等量混合，如上法處理切片。結果應為陰性。為證明此種染色抑制不是由于熒光抗體被稀釋所致，可用鹽水代替未標記抗血清，染色結果應為陽(yáng)性。此法結果較二步法穩定。

③類(lèi)屬抗原染色試驗，前面已作敘述。  直接法比較簡(jiǎn)單，適合做細菌、螺旋體、原蟲(chóng)、真菌及濃度較高的蛋白質(zhì)抗原如腎、皮膚的檢查和研究。此法每種熒光抗體只能檢查一種相應的抗原，特異性高而敏感性較低。

? 間接法

（1）切片固定后用毛細滴管吸取經(jīng)適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然后用0.01mol/l pH7.2PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。  （2）再滴加間接熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等），同上步驟，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。

對照染色：

①抗體對照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進(jìn)行染色，結果應為陰性。

②抗原對照：即類(lèi)屬抗原染色，亦應為陰性。

③陽(yáng)性對照。 間接法中上述方法稱(chēng)雙層法（Double Layer Method）。

另一種稱(chēng)夾心法，即用未標記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應抗體結合，再用該抗原之熒光抗體重疊結合其上，而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在，方法步驟如下：

①切片或涂片固定后，置于染色濕盒內。  

②滴加未標記的特異性抗原作用切片于37℃，30min。

③緩沖鹽水洗2次，每次5min，吹干。  

④滴加特異性熒光抗體再用切片于37℃，30min。

⑤如③水洗。  

⑥緩沖甘油封固，鏡檢。 

間接法只需制備一種熒光抗體可以檢出多種抗原，敏感性較高，操作方法較易掌握，而且能解決一些不易制備動(dòng)物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查，所以已被廣泛應用于自身抗體和感染病人血清的試驗。

? 補體法

1．材料

（1）免疫血清60℃滅活20min，用Kolmers 鹽水作2倍稀釋成1：2，1：4，1：8……。補體用1：10稀釋的新鮮豚鼠血清，抗補體熒光抗體等，按下述的補體法染色。免疫血清補體結合的效價(jià)，如為1：32則免疫血清應作1：8稀釋。

（2）補體用新鮮豚鼠血清一般作1：10稀釋或按補體結合反應試管法所測定的結果，按2單位的比例，用Kolmers鹽水稀釋備用。Kolmers鹽水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸緩沖鹽水中，溶解MgSO4的含量為0.01%濃度。

（3）抗補體熒光抗體：在免疫血清效價(jià)為1：4，補體為2單位的條件下，用補體染色法測定免疫豚鼠球蛋白熒光抗體的染色效價(jià)，然后按染色效價(jià)1：4的濃度用Kolmers鹽水稀釋備用。

2．方法步驟  

（1）涂片或切片固定。  

（2）吸取經(jīng)適當稀釋之免疫血清及補體之等量混合液（此時(shí)免疫血清及補體又都稀釋一倍）滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定濕度的染色盒內。

（3）用緩沖鹽水洗2次，攪拌，每次5min，吸干標本周?chē)骸?（4）滴加經(jīng)過(guò)適當稀釋之抗補體熒光抗體30min，37℃，水洗同（3）。

（5）蒸餾水洗1min，緩沖甘油封固。

3．對照染色

（1）抗原對照。  

（2）抗血清對照：用正常兔血清代替免疫血清。  

（3）滅活補體對照：將補體經(jīng)56℃30min處理后，按補體同樣比例稀釋?zhuān)c免疫血清等量混合后，進(jìn)行補體法染色。