污染向來(lái)是在細胞培養中的大問(wèn)題。預防或治理污染是細胞培養成功的關(guān)鍵因素。我們在細胞培養時(shí)，在開(kāi)始階段就要十分重視污染問(wèn)題，否則會(huì )前功盡棄，這樣不僅浪費時(shí)間，也會(huì )浪費人力、物力。  
 
(一) 有哪幾類(lèi)污染？
      在細胞培養過(guò)程中的污染不只是指微生物，而且還包括所有混入培養環(huán)境中的、對細胞生存有害或造成細胞不純的物質(zhì)，包括生物和化學(xué)物質(zhì)。   
 
1、細菌污染
    細菌污染是實(shí)驗室細胞培養中常見(jiàn)的污染，即使在細胞培養液中加入了抗菌素，也可能因為操作不慎而引起污染。最常見(jiàn)的有革蘭氏陽(yáng)性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見(jiàn)。培養細胞受細菌污染后，會(huì )出現培養液變混濁，pH改變。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。   
 
2、真菌污染
     真菌污染是細胞培養過(guò)程中最常見(jiàn)的一種，最常見(jiàn)的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養細胞受真菌污染后，可見(jiàn)培養液中漂浮著(zhù)白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長(cháng)，培養液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見(jiàn)絲狀、管狀或樹(shù)枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養基中，有的呈鏈狀排列。  
真菌污染后，細胞生長(cháng)變慢，但最后由于營(yíng)養耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。
 
3、支原體污染
     支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2μm，一般過(guò)濾除菌無(wú)法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結構。開(kāi)始不易發(fā)現，能在偏堿條件下生存，對青霉素有抗藥性。多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。  
培養細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見(jiàn)細胞生長(cháng)增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數細胞污染后無(wú)明顯變化，或略有變化，若不及時(shí)處理，還會(huì )產(chǎn)生交叉污染。   
 
4、病毒污染
     組織細胞培養過(guò)程中，如果沒(méi)有除去潛在的病毒，就會(huì )產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養中已發(fā)現不少于20種血清性病毒。管病毒污染的細胞不影響原代培養，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。    
 
5、非同種細胞污染
     由于細胞培養操作時(shí)各細胞株所需的器材和溶液沒(méi)有嚴格分開(kāi)，往往會(huì )使一種細胞被另一種細胞污染。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實(shí)驗宣告無(wú)效。  
  
     細胞培養物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細胞培養所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。
 
（二）污染類(lèi)型的區別
    1、細菌、真菌污染的檢測
         (1) 肉眼觀(guān)察----細菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開(kāi)放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時(shí)內可明顯觀(guān)察到，例如培養液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。  
         (2) 接種觀(guān)察----用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養液接種，也可發(fā)現是否有污染。   
         (3) 鏡下觀(guān)察----倒置顯微鏡的高倍鏡下可見(jiàn)培養液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細菌污染。細胞之間有絲狀、管狀、樹(shù)枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。   
 
   2、支原體污染的檢測
       (1) 相差顯微鏡觀(guān)察----接取少許培養液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀(guān)察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細胞與細胞之間，有時(shí)可見(jiàn)類(lèi)似于布朗運動(dòng)的表現。
  注意與細胞破碎溢出的內容物如線(xiàn)粒體等相區別。  
       (2) 熒光染色法觀(guān)察----熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結合，可使支原體內的DNA著(zhù)色，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在于細胞周?chē)蚋接诩毎砻妗? 
       (3) 電鏡檢測----條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀(guān)察。一般在細胞培養48～72小時(shí)，細胞接近匯合前，用胰酶消化細胞制成細胞懸液后進(jìn)行固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀(guān)察。  
       (4) 培養檢測----細胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養基，培養14天后觀(guān)察肉湯培養有無(wú)霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養基中，再用瓊脂培養基做分離培養，37℃培養3天觀(guān)察有無(wú)“荷包蛋”菌落出現。  
 
   3、病毒的檢測
       (1) 應用電鏡技術(shù)快速診斷動(dòng)物病毒病  
       (2) 逆轉錄_聚合酶鏈反應RT_PCR檢測病毒   
 
（三）污染清除方法
         培養細胞一經(jīng)污染，多數較難處理。如果污染細胞價(jià)值不大，宜棄之；在尋找原因后徹底消毒操作室，復蘇或重新購置細胞，再培養。  
         污染細胞價(jià)值較大，又難于重新得到，可采取以下辦法清除。
 
    1、細菌和真菌的清除
         抗生素對殺滅細菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染后再用藥效果好。  
         預防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法，于加藥后作用24～48小時(shí)，再換常規培養液。此法在污染早期有效。
 
     2、支原體的清除

         (1) 用MRA處理 -----

              用MRA（Mycoplasma Removal Agent）處理細胞，每4天換一次液,連續處理15天以確保細胞純潔健康，效果好。   

         (2) 用清洗純化法清除支原體污染的方法 -----

             細胞營(yíng)養馴化→優(yōu)質(zhì)細胞群的篩選→細胞清洗→反復離心洗滌。
             其原理是利用離心力、細胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的。由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細胞外寄生,所以通過(guò)反復洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體   數量降低至極限.
             如結合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。

         (3) 藥物輔助加溫處理 ----- 

              先用藥物處理后，再將污染的組織培養物放在41℃培養18小時(shí)，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。

         (4) 使用支原體特異性血清  

              用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長(cháng)，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉為陰性，并且5個(gè)月后仍為陰性。
             但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經(jīng)濟。   
 
（四）污染的預防
         預防是防止細胞培養過(guò)程中發(fā)生污染的最好辦法。只有預防工作做在前，才能將發(fā)生污染的可能性降到最小程度。  
 
         一般預防可從以下幾方面著(zhù)手：

         1、添加抗生素

         2、從物品、用品消毒滅菌著(zhù)手 -----

             細胞培養所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，并在無(wú)菌試驗陰性后才能使用。操作室及剩余的無(wú)菌器材要定期清潔消毒滅菌。   

         3、從操作者做起 -----

            (1) 進(jìn)無(wú)菌室前要用肥皂洗手，按規定穿隔離衣。工作開(kāi)始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。
            (2) 操作者動(dòng)作要輕，必須在火焰周?chē)鸁o(wú)菌區內打開(kāi)瓶口，并將瓶口轉動(dòng)燒灼。操作時(shí)盡量不要談話(huà)，若打噴嚏或咳嗽應轉向背面。
            (3) 操作時(shí)要常更換吸管，一旦發(fā)現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去。實(shí)驗完畢用消毒水浸泡的紗布擦臺面。

        4、防止細胞交叉污染 -----

            (1) 在進(jìn)行多種細胞培養操作時(shí)，所用器具要嚴格區分。 
            (2) 在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細胞培養瓶瓶口，以免把細胞帶到培養液中污染其他細胞。   '
            (3) 細胞一旦購置或從別處引入，均應及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可重新復蘇培養。

        5、無(wú)菌室的徹底消毒 -----

            (1) 0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無(wú)菌室；
            (2) 甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣休對各種細菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。
            (3) 細胞培養，首先要避免污染，但在細胞培養過(guò)程中，有了污染用適當的方法清除，這樣也可以保證細胞培養的成功。