擬南芥幼苗蛋白免疫共沉淀為例詳解實(shí)驗步驟：

1、擬南芥幼苗在液氮中充分研磨

2、將粉沫轉入到預先加入了3倍體積的細胞IP裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑)小燒杯中 , 冰上輕輕攪拌，讓其在冰上融化，后轉入離心管中，4℃，13000rpm離心20min，上清轉移至新管

3、加入1μg相應的抗體和10-50 μl protein A/G-beads， 輕輕轉動(dòng)4℃孵育1h

4、4℃，4000rpm離心5min , 將蛋白抗體磁珠復合物離心至管底，棄上清

5、用裂解緩沖液清洗兩次，棄去上清，最后一次上清一定要盡量去干凈

6、加入45ulLSDS loading Buffer，沸水中煮5min , 冷卻到室溫后離心，上清液進(jìn)行SDS-PAGE，WesternBloting及下游實(shí)驗檢測。

注意事項：

1、樣品處理的質(zhì)量決定抗原抗體反應中抗原的質(zhì)量，需要控制所有操作在冰上或4℃；

2、細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，防止蛋白降解。多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100）。針對不同的實(shí)驗目的和蛋白質(zhì)特性選擇不同的裂解液。

3、實(shí)驗時(shí)需要使用對照抗體包括陰性和陽(yáng)性，陰性對照一般是同種屬的IgG，陽(yáng)性對照可以選用已知的細胞內某種蛋白抗體。