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凝膠遷移實(shí)驗(EMSA)實(shí)驗方法(二)

      三、實(shí)驗結果展示(美國Signosis EMSA實(shí)驗結果)





      四、Super-Shift EMSA


      非純化的蛋白樣本和一個(gè)特定的探針可形成一個(gè)或幾個(gè)特異的蛋白復合物。確定復合物中蛋白的特征可能會(huì )困難,可以加入目的蛋白的抗體,進(jìn)行超遷移實(shí)驗,即Super-Shift EMSA??贵w和蛋白/探針復合物中的蛋白結合,使復合物的遷移延遲,形成超遷移。

Super-Shift EMSA工作原理;在反應體系中,抗體與DNA/蛋白復合物中的蛋白產(chǎn)生反應形成復合物會(huì )引起復合物的體積變大,在非變性凝膠中的移動(dòng)變慢而與DNA/蛋白復合物區別開(kāi)。


      進(jìn)行Super-Shift EMSA需要考慮以下因素:


      1)一般先做一般的EMSA測定,成功后才考慮做Super-Shift EMSA實(shí)驗。


      2)不是所有的抗體都可以用于Super-Shift EMSA,只有對非變性蛋白的表面抗原決定簇起反應的抗體才能夠用于Super-Shift EMSA。


      3)抗體的濃度要高。一般10-20ul的反應液需要使用0.5-1ul原倍的抗體。


      4)為減少非特異性反應,盡量使用純化的抗體。


      5)單抗與多抗都可用于Super-Shift EMSA,但多抗可能與DNA/蛋白復合物形成大的聚集物而不進(jìn)膠。在這種情況下,雖然看不到Super-Shift的帶,但應當可以看到DAN/蛋白復合物的電泳帶明顯減少。


      (本文轉載丁香通)

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