ChIP-Seq分析常見(jiàn)問(wèn)題集錦
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-20
染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-Seq）是指對染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）獲得的DNA片段進(jìn)行大規模測序，并能把所研究蛋白的DNA結合位點(diǎn)精確定位到基因組上。
Roche GS FLX Titanium 、Illumina Hiseq2000和AB SOLID 4 這3種測序技術(shù)均可以用于ChIP-seq，其中采用Illumina Hiseq2000進(jìn)行ChIP-Seq已有較多文獻報道。
ChIP-Seq技術(shù)高質(zhì)量、高通量、低成本的數據產(chǎn)出，為表觀(guān)遺傳組學(xué)研究奠定了技術(shù)基礎。研究者可以在以下幾方面展開(kāi)研究：
（1）判斷DNA鏈的某一特定位置會(huì )出現何種組蛋白修飾；
（2）檢測RNA polymerase II及其它反式因子在基因組上結合位點(diǎn)的精確定位；
（3）研究組蛋白共價(jià)修飾與基因表達的關(guān)系；
（4）CTCF轉錄因子研究。
ChIP-Seq有什么樣品要求？
（1） 請提供濃度≥10 ng/ul、總量≥20 ng、OD260/280為1.8~2.2的DNA樣品；若單次ChIP后DNA量不夠，建議將2~3次ChIP的DNA合并在一起。
（2）請提供DNA打斷時(shí)檢測膠圖，要求打斷后DNA電泳主帶在100-500 bp范圍內；請對于ChIP獲得 DNA設計引物進(jìn)行QPCR驗證和定量，能夠提供檢測位點(diǎn)的檢測報告。附陽(yáng)性和陰性對照。
（3）樣品請置于1.5 ml管中，管上注明樣品名稱(chēng)、濃度以及制備時(shí)間，管口使用Parafilm封口。在運輸前將所有樣品管固定于50 ml帶蓋離心管中，再將50 ml管放在封口袋中。為了防止低濃度樣品黏附在離心管壁上，請使用non-stick tube運輸DNA ；建議使用冰袋運輸，并且盡量選用較快的郵遞方式，以降低運輸過(guò)程中樣品降解的可能性。
ChIP-Seq相比ChIP-chip有哪些優(yōu)勢？
（1）ChIP-Seq 能實(shí)現真正的全基因組分析。目前所能獲得的芯片上固定的探針只能代表全基因組部分序列，所獲得的雜交信息具有偏向性；
（2）對于結合位點(diǎn)分析，ChIP-Seq 通過(guò)尋找“峰”，結合分辨率可精確到10~30 bp，而芯片上探針由于長(cháng)度所限，無(wú)法精確定位，即使目前最高水平的商業(yè)芯片都無(wú)法提供可與ChIP-Seq 媲美的分辨率；
（3）是所需樣本數量。ChIP-chip 需要多達4~5 μg 的起始樣本，在雜交之前需要進(jìn)行LM-PCR，但可能導致背景增高，競爭性擴增等導致假陽(yáng)性。而ChIP-Seq 僅需要納克級起始材料，如SOLiD 起始材料可低至20ng。
ChIP-Seq測序文庫的構建方法？
目前為止，唯有Illumina在ChIP-seq領(lǐng)域被廣泛報道，采用Illumina測序其ChIP-seq測序文庫構建方法如下
（1）ChIP富集DNA片段。首先用甲醛將活體細胞交聯(lián)，隨后將細胞核內的染色質(zhì)用超聲波打斷成目標長(cháng)度（通常0.2-1kb）的短片段形式，用所研究的蛋白特異性抗體將蛋白結合的DNA片段免疫共沉淀，接下來(lái)將蛋白質(zhì)-DNA復合物解交聯(lián)并純化DNA片段。
（2）構建測序文庫。對于ChIP富集的DNA片段純化后，經(jīng)末端補平，3’末端加A，連接接頭一系列處理后，進(jìn)行電泳割膠，回收150-300bp范圍左右的片段，然后對回收的DNA片段進(jìn)行PCR擴增，上機測序。所測序列首先進(jìn)行基因組比對然后用不同的算法進(jìn)行結合位點(diǎn)的統計。
樣品制備過(guò)程中是否需要PCR擴增？PCR擴增后是否會(huì )影響最后的結果？還有那些因素會(huì )影響ChIP-Seq的結果？
由于ChIP下來(lái)的DNA樣品量非常少，所以在樣品制備過(guò)程中需要經(jīng)過(guò)一步PCR擴增的過(guò)程，PCR擴增主要是為了獲得足夠上機反應的DNA量。如果客戶(hù)能夠提供足夠量的DNA樣品，我們不再進(jìn)行PCR擴增。由于是線(xiàn)性擴增，擴增前后的結果很相似，基本上不會(huì )影響測序結果?？贵w的質(zhì)量，特異性，實(shí)驗設計，ChIP的實(shí)驗操作，DNA片段長(cháng)度范圍，測序通量，測序質(zhì)量等都會(huì )影響ChIP-Seq的結果。
ChIP-Seq測序對照的選擇？
ChIP-seq過(guò)程中，由于DNA富集過(guò)程受多種因素的影響。因此，在做ChIP實(shí)驗時(shí)，一定要做好實(shí)驗對照。因為沒(méi)有對照，很難對實(shí)驗結果的可靠性進(jìn)行評估。一般有三種實(shí)驗對照：Input對照、陽(yáng)性對照和陰性對照。
（1）Input對照：在進(jìn)行免疫沉淀前，需要取一部分斷裂后的染色質(zhì)做Input對照。Input是斷裂后的基因組DNA，需要與沉淀后的樣品DNA一起經(jīng)過(guò)逆轉交聯(lián)，DNA純化，以及最后的PCR或其他方法檢測。Input對照不僅可以驗證染色質(zhì)斷裂的效果，還可以根據Input中的靶序列的含量以及染色質(zhì)沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對照是ChIP實(shí)驗必不可少的步驟。
（2）陽(yáng)性對照和陰性對照：陽(yáng)性抗體和陰性抗體對照是最基本的實(shí)驗對照。陽(yáng)性抗體通常選擇與已知序列相結合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNA Polymerase II抗體等。陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。目的蛋白抗體的結果與陽(yáng)性抗體和陰性抗體的結果相比較，才能得出正確結論。如果目的蛋白沒(méi)有商品化的適用于染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗的抗體，只有其他用途的抗體時(shí)，可以先做蛋白質(zhì)免疫沉淀（Immunoprecipitation）檢測。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗的檢測。
只要采用高通量測序，就一定可以達到高分辨率？導致ChIP-seq測序假陽(yáng)性比較高的因素？
高通量的測序確實(shí)大大提高了ChIP檢測的分辨率，但并不是高分辨率的唯一決定因素。免疫富集后，染色質(zhì)被打斷的片段長(cháng)度也會(huì )影響分辨率。DNA打碎方法、染色質(zhì)開(kāi)放程度的不均一性、PCR擴增偏向性、基因組的重復程度以及測序和序列比對過(guò)程中的錯誤都會(huì )引入系統誤差造成假陽(yáng)性，測序后首先將序列比對到已知基因組上并確立真正的結合位點(diǎn)（峰，peak）。對于轉錄因子，要尋找“峰”對應的下游調控基因（靶基因），或者構建轉錄因子結合位點(diǎn)的保守結合序列，如果轉錄因子的motif是已知的，則可以計算“峰”序列中包含motif序列的百分比，間接估計實(shí)驗結果的可靠性。
