1. 從原核基因組中制備　原核基因組相對較小，用幾種限制性?xún)惹忻阜謩e消化原核基因組，或用某種限制性?xún)惹忻笇λ芯康幕蚪M進(jìn)行部分消化，可以得到大小不等的各種片段，其中有些片段就會(huì )含有目的基因，將這些片段插入載體中進(jìn)行克隆，經(jīng)過(guò)篩選，可以得到所需的目的基因。

   根據已發(fā)表的基因序列設計并合成引物，采用PCR（以基因組DNA為模板）或RT-PCR（以mRNA為模板）從組織或細胞中獲取目的基因片段用于基因操作，這是實(shí)驗室中最常用的獲取已知基因的方法。

   利用PCR獲取目的基因的一大優(yōu)點(diǎn)就是可以根據需要在引物序列上設計適當的酶切位點(diǎn)、起始密碼子或終止密碼子等，或通過(guò)人為錯配改變堿基序列（人工突變）對目的基因進(jìn)行有限修飾。對于未知基因，可采取構建RT-PCR文庫的方法獲得未知基因：利用mRNA末端poly A序列尾設計共用引物，將所有mRNA逆轉錄成cDNA，利用各種工具酶在cDNA末端加尾，然后采用一對共用引物擴增所有cDNA片段，將經(jīng)PCR擴增后的片段插入到適當載體中，構建成PCR-cDNA文庫。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以將表達水平很低的mRNA擴增出來(lái)，有利于篩選出表達豐度低的基因。由于經(jīng)過(guò)PCR擴增，基因序列的精確性需要采用其他方法進(jìn)一步確定。

   還有一個(gè)獲得目的基因的方法是利用計算機技術(shù)進(jìn)行“計算機克隆”，即利用GenBank中的基因信息，通過(guò)軟件比較不同種屬基因之間的相似性（同源性），利用保守區序列設計引物，再用PCR或RT-PCR從不同種屬或不同組織細胞中獲取未知的基因片段。這是目前可實(shí)現的一種獲得新基因的捷徑。

   將基因組DNA用限制性?xún)惹忻赶蟛迦氲竭m當載體中，得到含有不同插入片段的克隆載體，這種克隆載體的混合物含有長(cháng)短不同的基因組片段，這就是基因文庫。若將細胞內所有mRNA均逆轉錄成cDNA，然后將所有cDNA片段克隆到適當的載體中，構建成含有不同cDNA片段的克隆載體混合物，這就是cDNA文庫。目前許多組織或細胞的基因組或cDNA文庫都可以從商業(yè)公司買(mǎi)到。

當獲得了基因組文庫或cDNA文庫，可以根據已知的信息合成特異性探針，采用核酸分子雜交的方法從文庫中篩選感興趣的基因片段，這仍是目前獲得新基因的一種常用手段?；蚪M文庫或cDNA文庫的構建和使用請參見(jiàn)本書(shū)相應的章節。 

   采用DNA合成儀，對目的基因進(jìn)行分段合成，然后進(jìn)行連接，可以得到所需的目的基因?；瘜W(xué)合成法可以改變原始的基因序列，甚至可以合成自然界不存在的序列。在合成過(guò)程中可以根據需要改變核苷酸的密碼子，如將真核基因序列中不易在E. coli中利用的稀有密碼子改成E. coli偏愛(ài)的密碼子，有利于真核基因在E. coli中的表達。

   獲得目的基因后必須將其放在一定的載體內才能在宿主細胞內擴增或表達。目的基因與載體的連接及其后續的轉化過(guò)程習慣上稱(chēng)為克?。╟loning）。由于目前很多基因都是利用PCR技術(shù)獲得，因此這里先介紹PCR產(chǎn)物的克隆策略，然后再介紹其他的克隆方式。

   獲得PCR產(chǎn)物通常只是克隆的第一步。無(wú)論研究的起始材料是RNA還是DNA，最重要的是要有一種有效的方法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆。目前已建立了多種對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆的方法，具體選擇哪種方法取決于以下幾個(gè)因素：PCR產(chǎn)物序列是否已知；載體上有哪些單一的限制性酶切位點(diǎn)可以利用；克隆PCR產(chǎn)物的用途等。

   1. 限制性?xún)惹忻该盖形稽c(diǎn)添加法　對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆的一個(gè)基本方法是利用目的片段所特有的限制性?xún)惹忻缸R別位點(diǎn)對產(chǎn)物進(jìn)行酶切消化。一般是在設計PCR引物時(shí)就要考慮到連接方式，直接在引物末端包含與載體相匹配的限制性?xún)惹忻肝稽c(diǎn)。設計PCR引物時(shí)必須考慮以下幾個(gè)因素：①如果PCR產(chǎn)物序列未知，那么在引物上所提供的位點(diǎn)有可能會(huì )出現在產(chǎn)物DNA中，使用這些位點(diǎn)進(jìn)行酶切時(shí)將會(huì )導致產(chǎn)物內部切割，產(chǎn)生缺失的克隆。②如果酶的識別位點(diǎn)靠近DNA末端，內切酶對DNA產(chǎn)物的切割效率會(huì )降低?？捎肒lenow酶、T4多聚核苷酸激酶及T4 DNA連接酶等處理PCR產(chǎn)物來(lái)克服這一缺陷：首先用激酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行處理，然后將PCR產(chǎn)物分子上的突出末端用Klenow酶補平，再用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，形成由多個(gè)PCR產(chǎn)物組成的串聯(lián)體，這種多聚體能被所采用的內切酶有效地切割。

   2. T/A克隆法　在PCR產(chǎn)物的克隆中，還可以利用含有單個(gè)胸腺嘧啶（T）3'突出端的線(xiàn)性化載體與帶有單個(gè)腺苷酸（A）3'突出端的DNA片段的連接來(lái)進(jìn)行克隆，這種克隆系統被稱(chēng)為T(mén)/A克隆。它利用了Taq DNA聚合酶具有延伸酶活性，即以不依賴(lài)模板的方式將一個(gè)核苷酸添加到已完成延伸的PCR產(chǎn)物的3'末端。對于多數DNA聚合酶，這個(gè)添加上去的核苷酸通常是A殘基。

有幾種酶可用來(lái)產(chǎn)生3'端帶有單個(gè)T突出末端的線(xiàn)性化載體，分別是MboII、XcmI和HphI。另外還有兩種方法可產(chǎn)生帶3'-T突出端的載體，一種是將一個(gè)T殘基加到經(jīng)過(guò)限制性?xún)惹忻妇€(xiàn)性化處理后產(chǎn)生平端的載體上，或者利用末端轉移酶加上一個(gè)雙脫氧胸腺嘧啶三磷酸（ddTTP）；另一種方法則是利用Taq DNA聚合酶具有的延伸酶活性，將一個(gè)A殘基加到DNA模板的3'端。為了在3'端加上一個(gè)T殘基，可在高濃度dTTP條件下，將平端載體與Taq DNA聚合酶共同孵育，在其他核苷酸不存在時(shí)，載體3'只能加上一個(gè)T殘基。目前，已有不少商業(yè)公司提供專(zhuān)門(mén)用于PCR產(chǎn)物克隆的T/A克隆載體。

   1. 黏性末端的連接　用一種適當的限制性核酸內切酶將目的基因和載體DNA消化，使它們兩端各具有相同的黏性末端，兩者的互補末端堿基配對，在DNA連接酶作用下，共價(jià)連接成新的DNA分子。

  （1）單一酶切的黏性末端間的連接：載體分子與外源DNA用同一種限制酶消化后連接有兩個(gè)缺點(diǎn)：①載體DNA兩端的黏性末端可以自身退火，產(chǎn)生載體——載體相連接的假陽(yáng)性克隆。為了減少和防止這種情況的發(fā)生，需用高濃度的外源DNA（插入片段與載體的比率一般為3:1），并用堿性磷酸酶將載體上的5'磷酸基團去掉。②不能定向插入。由于使用同一種內切酶，載體與插入片段的4個(gè)末端全為黏性互補順序，所以外源基因插入可有兩個(gè)方向。

    2. 平頭末端的連接　載體和外源DNA片段的末端是平頭也可以連接，但由于平端連接時(shí)反應更偏向于載體的自身環(huán)化，因此這種方法的效率要比粘端連接低。有幾種方法可提高平端連接的連接效率：①在連接反應中使目的基因片段分子數大大過(guò)量；②用堿性磷酸酶對載體進(jìn)行處理，去除載體兩端的5'磷酸基團。

   目的基因和載體在體外連接形成重組DNA分子后，需要被導入受體細胞中才能進(jìn)行增殖和（或）表達。接受重組DNA分子的細胞稱(chēng)作受體細胞或宿主細胞。受體細胞分為原核細胞（如大腸桿菌）和真核細胞（如酵母、昆蟲(chóng)細胞及哺乳動(dòng)物細胞）。原核細胞可作為基因復制擴增的場(chǎng)所，也可作為基因表達的場(chǎng)所；而真核細胞一般只用作基因表達系統。

   受體細胞是重組基因增殖的場(chǎng)所，所以對受體細胞也應具有幾點(diǎn)要求：①容易接納重組DNA分子；②對載體的復制擴增無(wú)嚴格限制；③不存在特異的能降解外源DNA的內切酶體；④不對外源DNA進(jìn)行修飾。由于載體的不同，所具備的篩選標志不同，所用的受體細胞也不同，因此可根據所用的載體選擇合適的受體細胞。

  一般將重組DNA分子導入原核細胞的過(guò)程稱(chēng)為轉化（transformation），而導入真核細胞的過(guò)程稱(chēng)為轉染（transfection）。

   將重組DNA分子和感受態(tài)大腸桿菌細胞相混合，使重組DNA分子進(jìn)入大腸桿菌中，就可以實(shí)現重組DNA分子的轉化。

   重組DNA分子導入受體細胞后是否得到擴增，擴增后的重組DNA分子是否正確，導入的重組DNA分子是否含有正確的插入片段，重組DNA分子能否表達插入的目的基因，一般可以采用以下幾種方法對重組DNA分子進(jìn)行鑒定。

   1. 抗生素篩選　可根據所選用載體的特性，尤其是抗藥基因的存在與否進(jìn)行初步篩選。例如載體具有抗氨芐青霉素的抗性基因，若轉化后的細胞能在含氨芐青霉素的培養基中生長(cháng)，說(shuō)明載體DNA被導入到了受體細胞中并且能夠擴增繁殖。但這種篩選并不能說(shuō)明目的基因一定連接到了載體上。但通過(guò)抗藥基因的失活篩選可以證明有外源基因插入。

   2. X-gal篩選　有些載體為了方便篩選，根據細菌乳糖操縱子原理，將LacZ基因構建到了載體的多克隆酶切位點(diǎn)處。如果目的基因連接成功，LacZ基因將由于目的基因的插入而失活，不能產(chǎn)生分解乳糖及其類(lèi)似物的半乳糖苷酶，菌落在含有X-gal的培養基上呈現白色，無(wú)目的基因插入的克隆菌落為藍色。根據這種特性，可以基本判斷重組成功與否。

   3. 酶切電泳鑒定　將重組DNA分子提取出來(lái)，用特定內切酶切割重組DNA分子并電泳。如果目的基因被成功地插入到了載體分子中，可以通過(guò)目的基因兩端的酶切位點(diǎn)將目的基因切割下來(lái)，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳即可以判斷目的基因的存在與否，這是簡(jiǎn)便而常用的鑒定方法。

  4. 序列分析　經(jīng)過(guò)初步鑒定后的重組DNA分子往往需要進(jìn)行目的基因片段的DNA序列分析，通常采用多克隆酶切位點(diǎn)兩端的載體序列作為測序時(shí)引物的結合位點(diǎn)，即所謂的通用引物。有關(guān)DNA序列分析技術(shù)將在有關(guān)章節詳細敘述。一般需要表達的目的基因都必須經(jīng)過(guò)DNA序列分析予以確認。