實(shí)驗方法原理
利用逆轉錄病毒轉染法將增強型綠色熒光蛋白基因導入人肺癌大細胞系NCI-H460，采用外科原位移植法建立肺癌原位移植模型。定期通過(guò)小動(dòng)物活體熒光成像系統觀(guān)察腫瘤生長(cháng)，利用相關(guān)性檢驗分析熒光面積和腫瘤體積之間的相關(guān)關(guān)系，并觀(guān)察原位移植術(shù)后裸鼠的生存期和腫瘤轉移情況。
實(shí)驗材料 BALB cnu nu裸鼠人非小細胞肺癌NCI-H460
試劑、試劑盒 EGFP表達載體大小鼠專(zhuān)用顆粒飼料胎牛血清生理鹽水青霉素鏈霉素RPM1-1640培養基
儀器、耗材 醋酸纖維濾膜C孵育箱96孔板針頭注射器鑷子棉簽凈化工作臺剪刀
實(shí)驗步驟
一、 實(shí)驗材料準備
BALB/c（nu/nu）裸鼠，雌雄不限。4周齡-6周齡，22只，體重18 g-22 g。所有裸鼠在SPF級屏障系統中飼養并進(jìn)行實(shí)驗（。飼養室相對濕度為（55±10）%，溫度為（22±2）℃，光照12 h明暗交替，裸鼠飼養用的飼料為鈷60輻射滅菌過(guò)的大小鼠專(zhuān)用顆粒飼料（江蘇省協(xié)同醫藥生物工程有限公司）。
二、 表達綠色熒光蛋白的H460肺癌細胞系的建立
1. 在含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素的RPM1-1640上清液中培養PT67包裝細胞。
2. 當細胞達到80%-90%融合濃度時(shí)收集培養液，經(jīng)孔徑為0.45 μm的醋酸纖維濾膜過(guò)濾后備用。
3. 轉染前24 h更新NCI-H460新鮮培養基，加入含逆轉錄病毒液的培養基轉染4 h后，置于37℃孵育箱孵育36 h，在熒光顯微鏡下觀(guān)察熒光。
4. 收集轉染細胞，在含200 μg/mL的G418選擇性培養基培養細胞。
5. 逐步將G418濃度增加200 μg/mL-400 μg/mL，直至抗性克隆形成。
6. 用96孔板單個(gè)細胞分離方法分離高表達GFP的克隆株，混合分離克隆株，使用常規方法擴增。
7. 經(jīng)體外連續傳代培養3個(gè)月，檢測熒光的表達強度。
三、原位移植模型的建立
1. 將H460-GFP細胞懸浮于PBS液中，調整細胞濃度為5×106/mL。
2. 消毒裸鼠左側腋下皮膚，將0.2 mL細胞懸液用1 mL帶有27G1/2針頭的注射器接種于2只裸鼠皮下，形成一皮丘，干棉簽壓迫。
3. 當皮下移植瘤長(cháng)至直徑約10 mm時(shí)剝取移植瘤，選擇生長(cháng)良好、瘤結無(wú)破潰的荷瘤裸鼠，在凈化工作臺內，無(wú)菌操作下完整剝離瘤結，生理鹽水洗去血漬。
4. 剪開(kāi)瘤結，清除中心的壞死組織，剪成直徑約1 mm大小的米粒樣小瘤塊。
5. 20只裸小鼠接受外科原位移植術(shù)。
6. 異氟烷吸入麻醉，將裸鼠置于右側臥位，四肢適當固定。
7. 消毒左側胸壁皮膚，在近第4、5肋間位置的皮膚切一0.4 cm-0.5 cm的橫切口，銳性分離胸壁肌肉，暴露肋骨和肋間肌，打開(kāi)胸腔。
8. 用鑷子固定左肺，將準備好的瘤塊縫合在左肺上，無(wú)菌縫合線(xiàn)縫合關(guān)閉胸腔。
9. 立即檢查縫合情況，如果漏氣，繼續縫合，直至胸壁完全縫合。
10. 用5 mL注射器做胸腔內穿刺抽氣，縫合胸壁肌肉和皮膚。
11. 裸鼠放回原飼養籠，繼續飼養。
四、 監測指標
1. 術(shù)后每天觀(guān)察裸鼠有無(wú)并發(fā)癥及異常情況（活動(dòng)，神經(jīng)功能，呼吸，動(dòng)物外觀(guān)）。
2. 腫瘤種植后每周麻醉處死2只裸鼠，共4周。
3. 銳性分離左側皮膚肌肉。
4. 在熒光體視顯微鏡下打開(kāi)胸腔和腹腔，分別在自然光源和熒光激發(fā)狀態(tài)下拍照。
5. 使用小動(dòng)物活體成像系統檢測GFP的表達，發(fā)射波長(cháng)為520 nm，激發(fā)波長(cháng)為480 nm，曝光時(shí)間為1 s，IPP軟件定量分析熒光面積。
6. 觀(guān)察原位移植瘤生長(cháng)情況，經(jīng)典方法測量腫瘤體積：用游標卡尺測量腫瘤的最長(cháng)徑（a）和與之垂直的最短徑（b），根據公式計算腫瘤體積：腫瘤體積（V）=ab2/2（a、b以mm為單位）。
7. 以腫瘤接種天數為橫坐標，腫瘤接種部位熒光面積為縱坐標，繪制原位腫瘤生長(cháng)曲線(xiàn)。
8. 其余裸鼠每周打開(kāi)胸部皮瓣，戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉裸鼠，或者用手固定裸鼠，在自然光源和熒光激發(fā)狀態(tài)下拍照。
9. 當裸鼠出現惡病質(zhì)后，解剖荷瘤鼠，肉眼觀(guān)察腫瘤生長(cháng)情況及周?chē)K器受累情況，并拍照。
五、統計學(xué)處理
采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統計分析，熒光面積和腫瘤體積用Mean±SD表示，Pearson相關(guān)性檢驗分析活體腫瘤面積與腫瘤體積之間的相關(guān)性，以P<0.05為差異具有統計學(xué)意義。（轉帖）
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