1、基于胚胎干細胞打靶的基因敲除與基因敲除小鼠

所謂基于胚胎干細胞打靶的 “基因敲除小鼠、基因敲除模式小鼠”，就是先在小鼠的胚胎干細胞上通過(guò)基因重組的辦法進(jìn)行基因修飾——將胚胎干細胞中的靶向基因改掉，然后將“修飾”后的胚胎干細胞植入小鼠的早期胚胎，生成嵌合體小鼠-基因敲除小鼠，基因敲除模式小鼠。這種嵌合體小鼠——基因敲除小鼠，基因敲除模式小鼠長(cháng)大后，體內同時(shí)存在被“修飾”過(guò)的基因和未被“修飾”的基因。當小鼠的生殖細胞恰巧被“修飾”過(guò)了，則它們就會(huì )生出基因完全被“修飾”過(guò)的基因敲除小鼠，基因敲除模式小鼠。

基因敲除（Gene knock-out），是建立在基因同源重組技術(shù)以及胚胎干細胞技術(shù)基礎上的一種新分子生物學(xué)技術(shù)?；蚯贸夹g(shù)是對一個(gè)基因，從分子水平上設計實(shí)驗，將該基因去除，或用其它基因取代，然后從整體觀(guān)察實(shí)驗動(dòng)物，推測相應基因的功能的一種技術(shù)。它克服了隨機整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。這項技術(shù)的誕生可以說(shuō)是分子生物學(xué)技術(shù)上繼轉基因技術(shù)后的又一革命。尤其是條件性、誘導性基因打靶系統的建立，使得對基因靶位時(shí)間和空間上的操作更加明確、效果更加精確、可靠，它的發(fā)展將為發(fā)育生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)及醫學(xué)等學(xué)科提供了一個(gè)全新的、強有力的研究、治療手段，具有廣泛的應用前景和商業(yè)價(jià)值。

基因敲除除可中止某一基因的表達外，還包括引入新基因及引入定點(diǎn)突變。既可以是用突變基因或其它基因敲除相應的正?；?，也可以用正?；蚯贸鄳耐蛔兓?。

2、上海中洪博元生物技術(shù)公司基因敲除模式小鼠制備技術(shù)

2.1打靶載體的構建

1.打靶載體的設計及構建：打靶載體的設計及構建是基因敲除小鼠、基因敲除模式小鼠開(kāi)發(fā)的第一步。是把目的基因和與細胞內靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，此重組載體即為打靶載體。因設計與開(kāi)發(fā)基因敲除小鼠、基因敲除模式小鼠目的不同，此載體有不同的設計方法，可分為替換性載體和插入型載體。如為了把某一外源基因引入染色體DNA的某一位點(diǎn)上，這種情況下應設計的插入型載體要包括外源基因(即目的基因)、同源基因片段及標記基因等部分。如為了使某一基因失去其生理功能，這時(shí)所要設計的替換型打靶載體，應包括含有此靶基因的啟動(dòng)子及第一外顯子的DNA片段及標記基因等諸成分。此外，還要對Southern轉染探針進(jìn)行設計、構建、預實(shí)驗及優(yōu)化等。

上海中洪博元生物技術(shù)有限公司具有獨特的、用于大片段DNA分子克隆技術(shù)并優(yōu)化了一套獨特的打靶載體構建技術(shù)，該技術(shù)可以大大地提高打靶載體構建速度，減少突變，同時(shí)易于胚胎干細胞重組和篩選等多重優(yōu)點(diǎn)。使得公司的基因敲除小鼠，基因敲除模式小鼠模型構建速度大大加快。

2.2胚胎干細胞的電轉和培養

小鼠胚胎干細胞（Embryonic stemcell, ESC）是基因敲除小鼠，基因敲除模式小鼠制備的關(guān)鍵材料。目前市場(chǎng)上供應的ES細胞通常質(zhì)量很不穩定，或是同源重組效率不高，或是不容易進(jìn)入種系傳代，難于滿(mǎn)足制備基因敲除小鼠，基因敲除模式小鼠的要求。實(shí)驗室需要對ES細胞進(jìn)行系統的研究試驗，才能找到重組率高，易傳代的ES細胞。我們公司自己研發(fā)并篩選C57BL/6遺傳背景的小鼠胚胎干細胞，所以可以直接得到C57BL/近交系模式小鼠，省去用129背景小鼠所需要的超過(guò)2年的回交時(shí)間。

將基因打靶載體通過(guò)電穿孔法導入同源的C57BL/6胚胎干細胞中，使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應部分發(fā)生同源重組，將打靶載體中的DNA序列整合到內源基因組中從而得以表達?？梢詷O大地縮短科研時(shí)間（7-9個(gè)月，節約一半的時(shí)間），節省資金，及提高科研的競爭力。由于其遺傳背景清晰，容易獲得重復性好的實(shí)驗結果。

2.3陽(yáng)性克隆的挑取和篩選：用選擇性培養基篩選已擊中的細胞：一般地，篩選使用正、負選擇法，比如用G418篩選所有能表達neo基因的細胞，然后用Southern進(jìn)行確認。將篩選出來(lái)的靶細胞導入鼠的囊胚中，再將此囊胚植入假孕母鼠體內，使其發(fā)育成嵌合體小鼠。

2.4通過(guò)觀(guān)察基因敲除小鼠，基因敲除模式小鼠的生物學(xué)形狀的變化進(jìn)而了解目的基因變化前后對小鼠的生物學(xué)形狀的改變，達到研究目的基因的目的?；蚯贸∈?，基因敲除模式小鼠已經(jīng)成為國內外科研機構、醫藥企業(yè)、醫院進(jìn)行基礎研究的重要工具。