實(shí)驗材料  樣品 DNA

試劑、試劑盒  引物dNTP 混合物反應緩沖液Taq DNA 聚合酶丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺TBE過(guò)硫酸銨

儀器、耗材  熱循環(huán)儀PCR 管電泳裝置

實(shí)驗步驟

一、PCR 反應實(shí)驗程序

 

      1.準備 PCR 反應混合物：根據 DNA 樣本的數量來(lái)確定除了 DNA 外其他混合物的體積（額外增加一份來(lái)確保有足夠的 PCR 反應混合物），將擴增每一個(gè)遺傳標記并且在每一個(gè) PCR 反應管內分 19.5uL 的反應混合物。

 

      2.在每個(gè)管子中加 0.5, 的 DNA 樣本。

 

      3.如果不用帶有加熱蓋的 PCR 儀，那么就需要在每個(gè)管子的頂部加入礦物油來(lái)防止液體蒸發(fā)。

 

      4.把管子放在 PCR 儀中，95°C 加熱 3 min 變性 DNA。

 

      5.95°C 變性 40s、55°C 引物退火 40s、72°C 延伸 40s，循環(huán) 30?35 次。

 

      6.72°C 終末延伸 7 min。

 

      7.把 PCR 產(chǎn)物和尿素上樣緩沖液 I:1 混合.

 

二、將 PCR 產(chǎn)物行測序膠（6% 膠，21 cmX40 cmX0.4 mm)

 

      1.配制膠溶液：將 25 g 尿素、7.5 mL40% 丙烯酰胺：PDA(19:1)、IOmL5XTBE 加入到 250 mL 的錐形瓶中。加蒸餾水至 50 mL。充分混勻來(lái)溶解尿素 (見(jiàn)注釋 4)。

 

      2..準備制膠板：把膠板洗干凈—確保上面沒(méi)有灰塵。用硅化玻璃板。根據各個(gè)廠(chǎng)家的不同把玻璃板夾在一起并且用膠條封住底部（這一過(guò)程根據設備的不同而有所變化)。

 

      3.加入 500uL 10% 的過(guò)硫酸銨到膠混合液中并且通過(guò)濾紙過(guò)濾。

 

      4.取出 10mL 膠溶液加入到一個(gè)小燒杯中并且加 10~15 斗 TEMED。馬上將膠倒到板上。幾分鐘之內膠將聚合到一起，封玻璃板的底部。

 

      5.封好膠后，加 15ul 的 TEMED 到剩余的膠溶液中并且馬上把膠倒到兩塊膠板之間。仔細插入膠梳子，讓膠聚合 2 h 至過(guò)夜。

 

      6.取下膠底部的封條。把膠放在電泳槽中確保電極插入的方向正確。將膠槽中灌滿(mǎn) 1XTBE.(大約 1.5L，根據裝置的不同量有所不同）。拔掉膠梳子，用 IXTBE 沖洗上樣孔。

 

      7.把膠預熱 60 min 直到溫度在 50°C 左右。

 

      8.在上樣之前再次用加樣器沖洗上樣孔。在每個(gè)孔中加 1?10/xL 的產(chǎn)物和上樣染料（上樣量根據梳子的大小和 PCR 產(chǎn)物的濃度而不同）。根據產(chǎn)物片段大小的不同跑膠時(shí)間可以從 30 min 到 3 h 之間變化。

 

三、銀染

 

      1.用一張 3 mm 厚的印跡紙把膠從測序膠裝置上取下。膠將粘到濾紙上直到把膠放在甲醇/冰乙酸溶液中才會(huì )游離。

 

      2.切掉膠的底部，這樣它將適合放在耐熱烤盤(pán)中而不至于自己卷曲。在每個(gè)步驟中用足夠的溶液將膠浸沒(méi)（大約 300 mL)。在染膠過(guò)程中盡可能避免用手觸摸膠。把膠鋪平避免折疊，用戴手套的手輕觸膠的角。在每一步的過(guò)程中，把膠留在盤(pán)中，將舊洗液倒干凈（可以用一片塑料板或一張洗過(guò)的帶有小孔的 X 線(xiàn)片把膠輕輕地拿起來(lái))。

 

      3.在耐熱盤(pán)中倒入新鮮配制的 10% 甲醇/10% 冰乙酸，將膠浸泡 15 min，同時(shí)輕輕搖動(dòng)耐熱盤(pán)使液體循環(huán)流動(dòng)。

 

      4.在 10% 的乙醇溶液中將膠沖洗 5 min。

 

      5.把膠浸在 0.5% 的硝酸溶液中恰好 30s。

 

      6.把膠用水充分沖洗 2 次。

 

      7.把膠浸在 0.012mol/L 的硝酸銀溶液中 15~30 min。

 

      8.快速充分的沖洗膠（用水把膠洗 2 次，任何洗不掉的硝酸銀都將產(chǎn)生沉淀，在膠上產(chǎn)生點(diǎn)狀沉積。膠不應該在水中浸泡時(shí)間過(guò)長(cháng)因為銀離子也可以被洗掉)。

 

      9.把膠浸在 300 mL 的顯色液中（當液體顏色變?yōu)樽厣蛻鼡Q新液體)。

 

      10.再用水沖洗一次。

 

      11.把膠浸在 10% 的冰乙酸中至少 2 min 來(lái)終止反應。?

 

      12.用水沖洗膠。

 

      13.用干膠器在兩塊玻璃紙之間干膠或者把膠放在 3 mm 的印跡紙上并且用包裝紙覆蓋頂部。

 

注釋

 

      1.DNA 通常是從 5~10mL 新鮮全血中提取獲得。我們通常選擇鹽析技術(shù)而不選擇酚。如果僅僅需要提取一定數量的樣品而不需要高質(zhì)量的 DNA 用于其他目的，那么可以制備初級裂解產(chǎn)物。DNA 也可以從其他組織中提取，例如，從簡(jiǎn)單的口腔沖洗液中提取的 DNA，其數量可以用于多個(gè) PCR 反應 [24]。如果僅能得到很少量的 DNA，那么對這些 DNA 的預擴增將很有用。

 

      2.引物可以通過(guò)定制合成（如果需要的量很大）。

 

      3.在標準擴增條件下，2 h 內將完成 3 個(gè)循環(huán)的 DNA 合成。當為一些特殊的引物優(yōu)化擴增條件時(shí)要考慮以下幾種因素：

 

      （1）沒(méi)有擴增或擴增很弱：試著(zhù)降低幾度退火溫度，引物濃度加倍，逐步升高鎂離子濃度或者增加 3~5 個(gè)循環(huán)數。

 

      （2）太多非特異擴增：試著(zhù)降低循環(huán)數，調節鎂離子濃度，增加退火溫度 2~5°C，降低 Taq 酶的濃度。

 

      （3）沒(méi)有產(chǎn)生引物二聚體擴增產(chǎn)物或者很弱：試著(zhù)降低引物濃度，增加上面提到的不擴增時(shí)采用的步驟。

 

      4.如果不用銀染，那么正常使用 bis(亞甲雙丙烯酰胺，iV，V-methylenebisacrylamide) 而不使用 PDA。PDA 是一種特殊的交聯(lián)劑，用來(lái)減少銀染背景的同時(shí)可以使膠更結實(shí)，這種交聯(lián)劑對于在銀染過(guò)程中用手移動(dòng)膠是必需的。用 bis 的交聯(lián)劑能夠用于銀染，但是由于膠很脆，這種交聯(lián)劑僅能用于小膠。

   （本文轉載丁香園）