ChIP是一種強大的確定蛋白或者組蛋白修飾在基因組上定位的實(shí)驗方法。染色質(zhì)被分離出來(lái)后采用抗體與抗原的結合來(lái)判定目的蛋白是否結合在特定的DNA序列上或者判定目的蛋白結合位點(diǎn)在全基因組范圍的分布（微陣列或DNA序列）。這種方法具有空間性與時(shí)效性。該實(shí)驗設計為如何在細胞中進(jìn)行ChIP實(shí)驗提供了詳細的步驟。
1. 交聯(lián)和細胞收獲
甲醛可以將蛋白質(zhì)交聯(lián)到DNA上。交聯(lián)結果的好壞決定于交聯(lián)時(shí)間的把握。我們建議樣品交聯(lián)的時(shí)間一般為2-30分鐘。過(guò)度的交聯(lián)會(huì )減少抗原的結合性和超聲斷裂的效率?？乖瓫Q定簇也會(huì )被掩蓋。加入甘氨酸可以消除甲醛使交聯(lián)反應終止。
1.1.準備兩個(gè)長(cháng)滿(mǎn)細胞的150cm2的細胞培養皿（1*107-5*107 個(gè)細胞/皿）。將甲醛直接滴入PBS洗過(guò)的細胞培養皿中，使其終濃度為0.75%，然后在室溫緩慢旋轉10分鐘，使蛋白和DNA發(fā)生交聯(lián)。
1.2 加入甘氨酸使其終濃度為125mM,在室溫晃動(dòng)孵育5分鐘。
1.3 使用10ml預冷PBS清洗細胞2次
1.4 使用細胞刮將細胞收獲放入 5ml 預冷PBS中，并轉入50ml的管子。
1.5.在皿里加入3mlPBS，將剩余的細胞轉移到50ml管子里1000g 離心5分鐘
1.6.將上清倒去，使用FA裂解液將沉淀重懸?。?x107cells/750μl).
初始細胞要有1*107-5*107個(gè)，采用終濃度為0.75%甲醛和如上描述的甘氨酸處理。預冷PBS洗3次，1，000g離心5分鐘，沉淀用FA裂解液重懸浮。
2 超聲破碎
超聲裂解細胞懸液可以將DNA均一的打斷成500-1000bp的片段。不同的細胞系需要不同的超聲時(shí)間才能達到最優(yōu)效果。
交聯(lián)細胞要通過(guò)時(shí)間梯度的超聲來(lái)選擇最優(yōu)超聲條件。樣品通過(guò)時(shí)間梯度，DNA的分離如部分3所描述。片段大小序在1.5%的瓊脂糖凝膠上檢測分析。如圖一所示
3.檢測DNA濃度
1INPUT樣品用于為后來(lái)的IP樣品計算DNA濃度。DNA可采用PCR純化試劑盒（加入70ul洗脫液，接著(zhù)進(jìn)入3.2a）或者采用酚/氯仿抽提（加入350ul洗脫液，接著(zhù)按照3.2b進(jìn)行）2a.加入2ulRNaseA(0.5mg/ml).加熱至65°C搖晃4-5小時(shí)或者過(guò)夜以逆轉交聯(lián)。DNA采用PCR純化試劑盒中廠(chǎng)家說(shuō)明進(jìn)行純化。樣品凍存于-20°C.
樣品之所以加入RnaseA是因為高濃度RNA會(huì )在使用PCR純化試劑盒時(shí)干擾DNA的純化。而純化柱子的飽和度是既定的。
2b.加入5ul蛋白酶K(20mg/ml).加熱至65°C搖晃4-5小時(shí)或者過(guò)夜以逆轉交聯(lián)。采用酚/氯仿抽提的DNA使用乙醇沉淀于10ul的糖原(5mg/ml).中。100ul水重懸浮。樣品凍存于-20°C.
樣品采用蛋白酶K處理可使相鄰肽段剪切成羧基團的芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸。蛋白質(zhì)和DNA之間的交聯(lián)通過(guò)DNA的純化被打斷。
3檢測DNA濃度，取5ul純化的DNA到995ulTE中得到一個(gè)原溶液的200倍稀釋測其OD260。
那么DNA的濃度就為OD260x10,000.μg/ml。這樣就可計算出染色質(zhì)制品的DNA濃度。
4免疫共沉淀
1 從2.2得來(lái)的染色質(zhì)制品，推薦每個(gè)IP樣品都采用25ug的DNA的量。每個(gè)樣品按1：10的量加入RIPA溶液。需要一個(gè)樣本作為空珠子的對照。
2在除空珠子對照樣品外每個(gè)樣品中加入一抗，抗體的量按照以往經(jīng)驗來(lái)加，1-10ug的抗體/25ugDNA效果較好。
3加入20ul的proteinA/G珠子（預先用超聲處理成為單鏈的鯡精DNA和BSA吸附，詳見(jiàn)步驟4.3a）到所有樣品總，4°C搖轉IP過(guò)夜。
3a將蛋白A/G珠子與單鏈鯡精DNA進(jìn)行預處理。如果同時(shí)使用蛋白A珠子和蛋白G珠子，等體積混合這兩種珠子使用RIPA溶液洗3次。除去RIPA溶液，加入單鏈鯡精DNA到珠子終濃度為75ng/μl，再用BSA將珠子終濃度定到0.1μg/μl。加入兩倍珠子體積的RIPA溶液在室溫孵育30分鐘。用RIPA洗一次，然后加入同體積的RIPA。
蛋白A珠子，蛋白G珠子或者它們的混合都可以使用。表格1顯示了蛋白A和蛋白G珠子對于不同免疫球蛋白同型的親和力。
4. 2000g，1分鐘離心蛋白A/G珠子，移除上清
5用1ml的WashBuffer溶液清洗珠子3次，2，000g，1分鐘離心，移除上清6用1ml的FinalWashBuffer溶液清洗珠子1次，2，000g，1分鐘離心，移除上清如果觀(guān)察到背景很高可以增加清洗次數，另外，超聲處理后的染色質(zhì)也可以在步驟4.2以前采用蛋白A/G珠子孵育1小時(shí)。任何非特異吸附都可以通過(guò)這附加的一步清除掉。將上清（聲處理的染色質(zhì)）倒入一個(gè)新的管子中按照步驟4.2使用抗體和珠子。
5. 洗脫和逆轉交聯(lián)
1. 使用120ulElutionBuffer洗脫液加入蛋白A/G珠子中30°C搖晃15分鐘洗脫DNA。
2. 2000g，1分鐘離心，將上清移入新的管子中。此時(shí)的樣品可以?xún)龃嬗?20°C3DNA可采用PCR純化試劑盒（步驟3.2a）或者酚/氯仿沉淀（加入280ul洗脫液，步驟見(jiàn)3.2b）4DNA的數量水平可通過(guò)定量PCR來(lái)檢測，引物和探針通?？梢允褂枚縋CR儀上的軟件設計，或者使用在線(xiàn)設計軟件也可。
（本文轉載丁香園）
