每一個(gè)做過(guò)分子克隆的人，都會(huì )經(jīng)歷過(guò)對條帶、對轉化子望眼欲穿的時(shí)刻，除了攢人品，每一步的細節也很重要。

一、PCR 引物設計

       通俗地說(shuō)，很多人用了很多軟件設計來(lái)設計去，又是考慮發(fā)夾結構，又是考慮二聚體，又是考慮 Tm 值，折騰來(lái)折騰去，但其實(shí)沒(méi)那么復雜。

       首先保證你要的基因是正確的，這個(gè)可以從 NCBI 中找到，大部分是沒(méi)問(wèn)題的，然后再找到起始密碼子，從那開(kāi)始大概上游取 20～27 bp，加上酶切位點(diǎn)，加上保護堿基（一般 3 個(gè)）就是上游引物，取后 20～27 bp 堿基，反向互補，加上酶切位點(diǎn)和保護堿基組成下游引物。這樣引物設計就完成了，可以放到軟件里看看 GC 含量，Tm 值，發(fā)夾結構，二聚體等，適當調整堿基個(gè)數和保護堿基的個(gè)數。需要額外注意的是移碼問(wèn)題。

二、PCR 產(chǎn)物

       兩種方式：一種純化后直接酶切連接；一種連 T 載體再往下酶切連接。我個(gè)人強烈建議第二種，連 T 載體。

       PCR 產(chǎn)物直接酶切有兩個(gè)缺點(diǎn)：

       1. 由于兩頭把手太短，雖說(shuō)有保護堿基，但我覺(jué)得還是不如從質(zhì)粒上往下切好切，而且容易切壞、切碎。

       2. 無(wú)法從電泳上看出來(lái)切沒(méi)切開(kāi)，因為也就切下了幾個(gè)或者十幾個(gè) bp，條帶沒(méi)啥變化。

       連 T 載體的優(yōu)點(diǎn)：

       1. 進(jìn)載體后，大提一次的質(zhì)?？鋸堻c(diǎn)說(shuō)夠用一輩子的，再說(shuō) PCR 那東西還不太穩定，一把多一把少的。

       2. 酶切會(huì )很清晰，切下來(lái)了就是有帶，沒(méi)切動(dòng)就是沒(méi)有，沒(méi)連上也能知道不是沒(méi)切開(kāi)而是別的步驟有問(wèn)題。

       連 T 載體也有些麻煩的地方，如需要的切點(diǎn)有時(shí)跟 T 載體上自帶的切點(diǎn)沖突，這就要小心鑒別。而且連 T 載體最好測序看一下 PCR 的產(chǎn)物對不對、切點(diǎn)對不對?？傮w來(lái)講連 T 載體是很有優(yōu)勢的。

三、提質(zhì)粒

       總體來(lái)說(shuō)，提質(zhì)粒問(wèn)題不大，都有試劑盒，按照步驟來(lái)，沒(méi)啥大問(wèn)題。有時(shí)手工小提或粗提的質(zhì)粒酶切效果不好，這可能是提取的不夠純或者內切酶品質(zhì)不好。所以若酶切效果不佳建議用柱子精提或大提。

四、酶切

       用于連接的酶切很關(guān)鍵。需注意如下幾點(diǎn)：

       1. 如果是雙酶切 A 和 B，預實(shí)驗中必須做 A 和 B 各自的單酶切和 A+B 的雙酶切，務(wù)必確認這幾種酶都好用，質(zhì)粒上的切點(diǎn)都好用。如果切不開(kāi)就要考慮是不是酶的問(wèn)題，buffer 的問(wèn)題，質(zhì)粒上有沒(méi)有這些切點(diǎn)，序列是否甲基化等。盡量選實(shí)驗室常用的內切酶。

       2. 酶切盡量用大體系，如 50 uL、100 uL 等。大體系能稀釋內切酶包裝中的甘油，對反應有利。相反，連接盡量用小體系，以增加 DNA 末端的碰撞機會(huì )。

       3. 如果要回收、連接，酶切用的 DNA 量不用太大。大了會(huì )切碎，形成一些不規則的末端，不利于連接。

       4. 酶切后的電泳，即切膠的那次電泳中，如果切成的條帶很清晰，不拖泥帶水，沒(méi)有彌散，沒(méi)有拖尾，那做回收、連接效果最好。相反，若有彌散、拖尾、不清楚、一團亮等情況就是切的不好，做后續實(shí)驗成功率會(huì )降低。若真是效果很差建議改進(jìn)體系重新切。

五、回收

       回收可以用柱式試劑盒或手工法。

       柱式回收試劑盒：此類(lèi)試劑盒適合各種長(cháng)度 DNA，對黏性末端基本沒(méi)有破壞，回收效率也不錯。

       手工醇沉淀法：步驟如下，把切得的膠弄碎，用 Tris-HCl 浸泡一段時(shí)間，吸出所有的液體，用酚抽提一遍，氯仿抽提一遍，加鹽和醇醇沉，沉淀用 70% 乙醇漂洗，再用 Tris 溶解。這個(gè)方法的優(yōu)點(diǎn)是對 DNA 和黏性末端的損傷最小，缺點(diǎn)是容易損失 DNA。若本來(lái) DNA 數量就不多，用手工法很容易丟失殆盡。如果 DNA 量很大可以考慮使用。

       回收后要跑電泳，一來(lái)估算回收液濃度，二來(lái)看回收 DNA 的質(zhì)量。若條帶有彌散，即自目的條帶以下有拖痕，不是清晰利落的一條帶，則質(zhì)量不好。因為條帶拖痕表示它已碎裂成比它小的各種長(cháng)度的片段，而主帶雖然還在那個(gè)位置但也已遭到一定程度的破壞。質(zhì)量不好的回收產(chǎn)物做連接成功率會(huì )降低，假陽(yáng)性克隆會(huì )增加。造成回收質(zhì)量差的原因可能是回收這步，也可能是酶切那步，如果酶切那步出現酶切中所描述的情況，就容易造成回收質(zhì)量不好。只有回收到清晰、利索的條帶，才不影響連接。

六、感受態(tài)

       做連接要求感受態(tài)的效率要高。感受態(tài)的感受效率一般剛制備完時(shí)是最高的，以后逐漸減弱，而且每次開(kāi)－80℃ 冰箱，溫度微升對感受態(tài)效率都有一定影響，久而久之效率就不行了，這就要求大家取感受態(tài)時(shí)動(dòng)作迅速、最大程度減少感受態(tài)盒升溫。

       都知道感受態(tài)效率高好，但麻煩的是感受態(tài)效率的高低不好通過(guò)實(shí)驗來(lái)檢測，因為若通過(guò)轉質(zhì)粒來(lái)檢測，只要是效率中等的感受態(tài)都能長(cháng)出很多克隆。所以如果你們的感受態(tài)已經(jīng)儲存了很長(cháng)時(shí)間或者連接長(cháng)的克隆連續幾把都太少就要重做感受態(tài)了。

       制備感受態(tài)不推薦新手直接去做，最好由經(jīng)驗豐富者做或他帶你做。用新做的感受態(tài)轉質(zhì)粒，用同樣手法用量，你會(huì )發(fā)現比舊感受態(tài)明顯多長(cháng)很多克隆。此外可以考慮購買(mǎi)感受態(tài)。

七、連接

       最后才輪到連接。連接的問(wèn)題討論的是比較多的。如果前述若干步驟所得產(chǎn)物質(zhì)量好，連接不會(huì )很難。

       1.DNA 的量：DNA 總量有幾十 ng 就能連接成。當然如果你的 DNA 質(zhì)量好 DNA 用量越大連接效率越高。就怕你為了追求 DNA 數量而降低了質(zhì)量，那可就得不償失了。

       2.vector 和 insert 的比例：如果 insert 不長(cháng)（2 kb 以下）、vector 是 insert 的幾倍長(cháng)，可以用 1：3～1：9。如果 insert 較長(cháng)（3～4 kb 以上）、vector 和 insert 長(cháng)度相似或 insert 比 vector 還長(cháng)，可以用 1：1～1：3。短片段的連接相對容易，做的好可以挑到好多正確的克隆。長(cháng)片段的連接效率較低，陽(yáng)性克隆率小于等于 10% 是很正常的。我做過(guò)一個(gè)長(cháng)片斷的連接，6 k 的 vector、6 k 的 insert，比例用 1：1，挑了 20 個(gè)克隆有一個(gè)對。

       3. 體系體積：通常用 20 uL 都能連上，若連長(cháng)片段可以壓縮成 10 uL（前提是 DNA 數量不變）。我覺(jué)得體系不是很關(guān)鍵，有位很精通克隆的老師說(shuō)他都用 50 uL 體系，照樣百發(fā)百中。而且如果你的 DNA 是用 EB（即 Tris）溶解的，體系中不加水也行。前述我自己連的長(cháng)片段也是用 20 uL 體系，vector 和 insert 各上 8 uL。

       4.T4 連接酶：酶這東西自然是越貴越好，一分錢(qián)一分貨，而且連接酶控制著(zhù)整個(gè)分子克隆過(guò)程的瓶頸——連接，強烈建議買(mǎi)好的。如果連長(cháng)片段就加二倍的連接酶。

       5. 連接時(shí)間：過(guò)夜就應該足夠了，但是你要是不急著(zhù)轉化，放到 4 度放幾天也行，我個(gè)人認為時(shí)間長(cháng)只好不壞。

       6. 連接溫度：最適是 16℃。有人用 PCR 儀造 16℃，也有人用水浴鍋。我用泡沫冰盒加涼水再添冰，用手感覺(jué)差不多十四五六度，然后蓋蓋過(guò)夜，基本上溫度不太變。你若感覺(jué)好不溫度，拿個(gè)溫度計測也行。有人用 4℃ 連接，也行，我有時(shí)先 16℃ 過(guò)夜，再放 4℃ 里幾天。

       7. 轉化：連接的轉化不能像轉質(zhì)粒那么隨便，要小心翼翼，盡量作到不放棄任何一個(gè)菌。一般所用的感受態(tài)體積最少是連接體系的 5 倍。長(cháng)片段的連接轉化時(shí)搖菌 2 小時(shí)。

       8. 對照：對照很關(guān)鍵，可以反應出很多重要的信息，不要懶，你的連接若是問(wèn)題不少，就要乖乖的做對照。一般有如下幾種對照方式：

       9. 轉化質(zhì)粒對照。和連接產(chǎn)物同樣抗性、一起轉化、涂在同一個(gè)板上。這個(gè)對照目的是檢測轉化系統是否有效，即抗生素是否有效、板子是否有效、轉化的手法是否正確、以及感受態(tài)的效率如何（這需要你每次轉化質(zhì)粒都用相同的手法、用量，看長(cháng)的菌落數，若明顯太少就要懷疑感受態(tài)）。還有一個(gè)作用，如果質(zhì)粒早就長(cháng)出來(lái)了，都長(cháng)挺大了你的連接產(chǎn)物還沒(méi)動(dòng)靜呢，那八成是沒(méi)戲了，別等了趕快去準備下次連接的材料。

       10. 切完回收的 vector 直接轉化對照。如果你是雙酶切，切完的 vector 和沒(méi)切的 vector 的長(cháng)度相差不大，或跑電泳這兩種跑不很開(kāi)，就要做這個(gè)對照。目的是看切的是否徹底，是否還有環(huán)狀質(zhì)粒存在。長(cháng)不出克隆是對的，若長(cháng)出克隆，好好改進(jìn)你的酶切體系。

       11. 切完回收的 vector 加連接酶自身連接再轉化做對照。雙酶切的，最好要做這個(gè)對照，而且這個(gè)對照長(cháng)的克隆要挑若干提質(zhì)粒。
若切完的目的 vector 和沒(méi)切的 vector 的長(cháng)度相差較大，電泳條帶離的遠，這個(gè)對照能檢測酶切和回收的質(zhì)量。如果 DNA 末端遭破壞或斷裂，會(huì )隨機產(chǎn)生各種末端，這些末端少數能連接到一起，長(cháng)度上小于等于回收的 vector。

       若切完的 vector 和沒(méi)切的 vector 的長(cháng)度相差不大，這個(gè)對照檢測是否有只進(jìn)行了單酶切的?？傊婚L(cháng)克隆或只長(cháng)很少是對的，長(cháng)多了還是去改進(jìn)上游的步驟。

（本文轉載丁香園）