一、毛細管電泳系統基本結構及特點(diǎn)
毛細管電泳系統基本結構:包括進(jìn)樣系統、兩個(gè)緩沖液槽、高壓電源、檢測器、控制系統和數據處理系統。
特點(diǎn):毛細管電泳通常使用內徑為25-100 μm 的彈性(聚酰亞胺)涂層熔融石英管。標準毛細管的外徑為375 μm,有些管的外徑為160 μm。毛細管的特點(diǎn)是:容積?。ㄒ桓?00 cm×75 μm 管子的容積僅4.4 μL);側面/截面積比大,因而散熱快、可承受高電場(chǎng)(100-1000 V/cm);可使用自由溶液、凝膠等為支持介質(zhì);在溶液介質(zhì)下能產(chǎn)生平面形狀的電滲流。
二、毛細管電泳優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn):
(1)高效塔板數目在105-106片/m間,當采用CGE 時(shí),塔板數目可達107片/m以上;
(2)快速,一般在十幾分鐘內完成分離;
(3)微量進(jìn)樣所需的樣品體積為nL級;
(4)多模式可根據需要選用不同的分離模式且僅需一臺儀器;
(5)經(jīng)濟實(shí)驗消耗不過(guò)幾毫升緩沖溶液,維持費用很低;
(6)自動(dòng)CE是目前自動(dòng)化程度較高的分離方法。
缺點(diǎn):
(1)由于進(jìn)樣量少,因而制備能力差;
(2)由于毛細管直徑小,使光路太短,用一些檢測方法(如紫外吸收光譜法)時(shí),靈敏度較低;
(3)電滲會(huì )因樣品組成而變化,進(jìn)而影響分離重現性。
(毛細管電泳色譜結果圖)
三、實(shí)驗操作簡(jiǎn)介
1、提取樣本DNA
2、進(jìn)行DNA變性
3、進(jìn)行DNA雜交
4、進(jìn)行DNA延伸反應
5、進(jìn)行PCR反應
6、CE檢測流程:
(1)樣品排板、建立上機清單;
(2)4個(gè)樣本各取1μL到上機板;
(3)每孔加入9μL HiDi:Liz 500(體積比為250:1),離心、震蕩混勻、再離心;
(4)95℃變性5min,迅速降到4℃;
(5)上ABI3730XL全自動(dòng)DNA測序儀檢測。
拷貝數變異(CNV)是人類(lèi)DNA遺傳變異的重要來(lái)源,在廣泛的疾病中發(fā)揮作用。運用毛細管電泳色譜結合探針可確定一次多重PCR反應中多達60個(gè)DNA序列的相對拷貝數,這對DNA樣本中的缺失和重復辨識具有重要的研究意義。