細胞復蘇、傳代及凍存實(shí)驗步驟:

     一、準備
     無(wú)菌超凈臺，酒精燈，75%酒精噴壺，CO2培養箱，37℃水浴鍋，離心機；培養瓶，含10%胎牛血清的完全培養基和基礎培養基以及PBS磷酸緩沖液（提前放置超凈臺使平衡到室溫），無(wú)菌工作服（白大褂），口罩，手套，記號筆
     二、步驟
     1、穿好無(wú)菌工作服，帶上口罩和手套，快速從液氮里取出凍存管，快速放進(jìn)37℃水浴鍋緩慢搖晃使細胞解凍，注意凍存管的封口膜不要破裂，防止污染。
     2、解凍后用紙擦干凍存管表面的水滴，酒精噴壺噴灑適量75%酒精消毒凍存管封口處。
     3、開(kāi)超凈臺，點(diǎn)燃酒精燈燃燒片刻后（可提前準備），凍存管放超凈臺，換新手套，小心打開(kāi)凍存管，避免污染，無(wú)菌吸管將1ml細胞全部吸出至5ml無(wú)菌EP管，補加9ml基礎培養基稀釋?zhuān)?000rpm，離心5min使細胞沉淀，棄上清。
     4、加入新鮮配制的含10%血清的培養基4ml，輕輕混勻，用吸管將細胞移至25T培養瓶。
     5、平躺放置培養瓶，8字形混勻后，置于37℃，5%CO2培養箱培養。
     6、培養24小時(shí)后，顯微鏡觀(guān)察細胞（貼壁細胞）貼壁后，小心更換培養基，繼續培養，根據不同細胞的生長(cháng)狀態(tài)進(jìn)行傳代培養，培養瓶上標記：操作者，時(shí)間，細胞類(lèi)型。
     7、有的實(shí)驗員的培養基會(huì )加入抗生素防止細胞污染，但是這對于掌握細胞培養是非常不利的，不加抗生素培養細胞更能提醒實(shí)驗者無(wú)菌操作的意識。一旦細胞出現污染，易于發(fā)現，一旦發(fā)現污染的細胞應立刻煮沸丟棄，以免污染同實(shí)驗室其他細胞。
     8、細胞長(cháng)滿(mǎn)90%-100%即可傳代，小心打開(kāi)培養瓶，瓶口過(guò)酒精燈消毒，棄培養基。
     10、加入1mlPBS，潤洗細胞，重復3次，棄PBS。
     11、加入4ml完全培養基，用無(wú)菌吸管小心吹打貼壁細胞或者用胰蛋白酶消化細胞使細胞脫落。
     12、轉移1/2脫落的細胞至新的培養瓶，各瓶補加完全培養基至4ml。
     13、小心封口，平躺放置培養瓶，8字形混勻后，置于37℃，5%CO2培養箱培養。
     14、待長(cháng)滿(mǎn)后，按同樣的方法傳代培養。

     三、凍存
     當不需要使用細胞或者細胞量足夠時(shí)，可以將細胞凍存起來(lái)，供以后實(shí)驗用

     四、準備
     細胞凍存液（20%血清、10%DMSO、70%基礎培養液），梯度降溫盒

五、步驟
     1、選取活力好，密度約70%細胞用于凍存，此時(shí)細胞處于對數生長(cháng)期，最適合用于凍存。
     2、細胞吹打或者胰酶消化后，轉移至無(wú)菌EP管，1000rpm里面5min。
     3、棄上清，加入新鮮配制的細胞凍存液，25T細胞可以加入2ml細胞凍存液，分裝2個(gè)凍存管，細胞最佳密度為5*106-1*107個(gè)每ml。
     4、做好標記，放入梯度降溫盒（提前平衡至室溫）。
     5、將梯度降溫盒放入-80℃冰箱過(guò)夜，第二天取出凍存管，快速放入液氮保存。

     遵循“快速復蘇，緩慢凍存”的原則。