實(shí)驗專(zhuān)欄丨擬南芥幼苗蛋白免疫共沉淀實(shí)驗步驟!
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發(fā)布時(shí)間：2018-02-05
一、 擬南芥幼苗蛋白免疫共沉淀為例詳解實(shí)驗步驟：
1、 擬南芥幼苗在液氮中充分研磨
2、 將粉沫轉入到預先加入了3倍體積的細胞IP裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑)小燒杯中 , 冰上輕輕攪拌，讓其在冰上融化，后轉入離心管中，4℃，13000rpm離心20min，上清轉移至新管
3、 加入1μg相應的抗體和10-50 μl protein A/G-beads， 輕輕轉動(dòng)4℃孵育1h
4、 4℃，4000rpm離心5min , 將蛋白抗體磁珠復合物離心至管底，棄上清
5、 用裂解緩沖液清洗兩次，棄去上清，最后一次上清一定要盡量去干凈
6、 加入45ulLSDS loading Buffer，沸水中煮5min , 冷卻到室溫后離心，上清液進(jìn)行SDS-PAGE，WesternBloting及下游實(shí)驗檢測。
二、注意事項：
1、 樣品處理的質(zhì)量決定抗原抗體反應中抗原的質(zhì)量，需要控制所有操作在冰上或4℃；
2、 細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，防止蛋白降解。多采用非離子變性劑（NP40或Triton X-100）。針對不同的實(shí)驗目的和蛋白質(zhì)特性選擇不同的裂解液。
3、 實(shí)驗時(shí)需要使用對照抗體包括陰性和陽(yáng)性，陰性對照一般是同種屬的IgG，陽(yáng)性對照可以選用已知的細胞內某種蛋白抗體。
