Tau 蛋白促進(jìn)軸突微管的裝配和穩定，保持微管間的距離，影響神經(jīng)細胞軸突的物質(zhì)運輸功能，Tau被異常磷酸化后阻礙微管的組裝過(guò)程，造成相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的運輸、儲存和釋放障礙，導致認知損害。

　　抑郁癥是一種常見(jiàn)的、嚴重的精神疾病，其終生患病率為 17.1%。電休克（electroconvulsive therapy，ECT）是治療抑郁癥的有效的方法，發(fā)作時(shí)間超過(guò)120～180 s 的 ECT 與認知損壞高度有關(guān)，其原因可能與強應激有關(guān)。應激可通過(guò)離子型 GluR 激活來(lái)調節 Tau 蛋白的磷酸化，興奮性神經(jīng)傳遞系統的激活，在應激誘導的海馬 Tau 蛋白的磷酸化中發(fā)揮重要的作用。已知，異丙酚和氯胺酮均可不同程度抑制神經(jīng)興奮性毒性；那么 ECT 等應激引起的谷氨酸（glutamate，Glu）升高是否通過(guò)上調 Tau 蛋白的過(guò)度磷酸化而造成認知障礙，異丙酚和氯胺酮是否可以阻止該過(guò)程，其分子機制和信號轉導通路為何，成為關(guān)注焦點(diǎn)。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗試劑

　　純品 Propofo（lSigma 公司）；純品 Ketamine（Sig-ma 公司）；純品 L- 谷氨酸（L-Glu，Sigma 公司）；小鼠抗牛 Tau5 單克隆抗體（Millipore 公司）；兔抗牛 p-PHF1Ser396/404單克隆抗體 （Abcam 公司）；兔抗人p-AT8Ser199/202多克隆抗體（Invitrogen 公司）；兔抗人p-12E8Ser262多克隆抗體 （Life Span Biosciences 公司）。

　　1.2 儀器設備

　　SuperMaze Morris 水迷宮視頻分析系統（上海欣軟信息科技有限公司）；Harvard 嚙齒類(lèi)動(dòng)物電休克儀（美國自然基金有限公司）；HPLC 色譜系統（美國 Waers 公司）；蛋白電泳系統（美國 Bio Rad 公司）；金盤(pán)多媒體圖像處理系統（成都金盤(pán)電子科大多媒體技術(shù)有限公司）；光學(xué)顯微照相系統（Olympus45，日本 Olympus 公司）。

　　1.3 實(shí)驗動(dòng)物

　　24 周健康雌性 Wistar-Kyoto（WKY）大鼠，體質(zhì)量 200～250 g，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗動(dòng)物中心提供；WKY 大鼠來(lái)源于京都大學(xué)遠系繁殖的 Wistar 大鼠，其天生對應激具有高反應且行為表現出內源性的抑郁癥狀，包括精神活動(dòng)延遲、行動(dòng)遲緩、快感缺乏等。該特性在 WKY 雌鼠身上表現更為普遍，故該模型可作為抑郁動(dòng)物模型。WKY 大鼠置于通風(fēng)良好、12 h 明暗交替、自由飲水和攝食條件下，每日觸摸 2 min。適應性飼養 1 周后，進(jìn)行曠場(chǎng)行為測試，測試均于上午 9：00開(kāi)始，選取水平得分和處置得分的總分 30～120 s 間的 48 只大鼠。

　　1.4 實(shí)驗方法

　　1.4.1 動(dòng)物實(shí)驗原則 所有動(dòng)物實(shí)驗均按照美國醫學(xué)研究協(xié)會(huì )《實(shí)驗動(dòng)物處理原則》以及美國科學(xué)學(xué)會(huì )和國家衛生研究院《實(shí)驗動(dòng)物使用和處理指南》進(jìn)行。

　　1.4.2 實(shí)驗動(dòng)物分組 采用隨機單位組析因設計：每只大鼠視為 1 個(gè)單位，對每單位施加 2 個(gè)處理因素，即 ECT 處置與否（2 水平：無(wú)處置、施行 1 個(gè)療程ECT）和實(shí)驗藥物使用與否（3 水平：注射生理鹽水、異丙酚、氯胺酮）的所有組合（2×3 析因設計）。

　　1.4.3 實(shí)驗動(dòng)物干預措施 通過(guò)隨機數字發(fā)生器將48 只 WKY 大鼠隨機分為 6 組（n =8）：生理鹽水組（靜脈注射 2 mL 生理鹽水）、異丙酚組（靜脈注射 2mL 5 mg/kg 異丙酚）、氯胺酮組（靜脈注射 2 mL 5mg/kg 氯胺酮）、生理鹽水 +ECT 組（靜脈注射 2 mL生理鹽水 +ECT 1 療程）、異丙酚 +ECT 組（靜脈注射2 mL 5 mg/kg 異丙酚 +ECT 1 療程）、氯胺酮+ECT 組（靜脈注射 2 mL 5 mg/kg 氯胺酮 +ECT 1 療程）。

　　1.4.4 ECT 處置 每次施行 ECT 前 15 min 靜脈注射相應藥物，然后于大鼠雙顳側安放電極，采用 Har-vard 嚙齒類(lèi)動(dòng)物電休克儀行 ECT 處理，給予方波（單個(gè)正弦半波 20 ms，50 Hz）、電流 50 mA、持續 1 s的電刺激，引起大鼠強直陣攣抽搐發(fā)作視為治療成功，隔天 1 次，共 7 次，均于上午 9：00 開(kāi)始進(jìn)行。不施行 ECT 處置的實(shí)驗組與施行 ECT 組，在同樣時(shí)間以同樣頻率和劑量注射相應藥物。

　　1.4.5 Morris 水迷宮視頻分析系統檢測實(shí)驗大鼠的認知功能 （同參考資料）

　　1.4.6 取材 在 Morris 水迷宮測試結束后 24 h 內取大鼠的海馬。大鼠左側海馬均分為 A、B 兩份，A份用錫箔紙標記包裹后置于液氮中過(guò)夜，然后置于-80℃超低溫冰箱中保存，備做 Western blot；B 份稱(chēng)重，加入 1 mL 甲醇 - 水離心液，低溫勻漿，取部分勻漿液 4℃、10 000 g 離心 15 min，取上清，濾膜過(guò)濾后 -80℃保存，待測 Glu 的含量（組織中含量以 μg/g 計）。大鼠右側海馬置于 4℃的 10%多聚甲醛中固定 3 d，脫水，石蠟包埋、切片（厚度 1μm），備行免疫組織化學(xué) SP 法顯色。

　　1.4.7 高效液相色譜法檢測神經(jīng)遞質(zhì) Glu 在大鼠海馬組織中的含量 同參考資料

　　1.4.8 Western blot 檢測 Tau5（總 Tau 蛋白）、p-PHF1Ser396/404、p-AT8Ser199/202、p-12E8Ser262在大鼠海馬組織神經(jīng)元中的含量 取 A 份大鼠左側海馬，勻漿，取 0.2 g，經(jīng) Western blot 及 IP 細胞裂解液提取蛋白，再用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，據此調節蛋白濃度一致。取等量蛋白樣品，用 5×SDS 加樣緩沖液按 1∶1（V/V） 稀釋待測樣品，于100℃煮沸 5 min；另用 1×SDS 加樣緩沖液溶解預染蛋白質(zhì)分子量標準混合物，置于 100℃煮沸 3 min。取待測標本 15μL 上樣 [甘油醛 -3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase，GAPDH，1∶200）作為蛋白質(zhì)上樣量的標定]，經(jīng)SDS-PAGE電泳至預染蛋白質(zhì)分子量標準所示目的分子量出現為止，用濕法將蛋白條帶電轉至 Immun-blottingPVDF 膜，50 g/L 脫脂奶粉封閉 3 h，加入相應抗體（小鼠抗牛 Tau5 單克隆抗體、兔抗牛p-PHF1Ser396/404單克隆抗體、兔抗人 p-AT8Ser199/202多克隆抗體、兔抗人 p-12E8Ser262多克隆抗體）（1∶200）4℃孵育過(guò)夜，相應辣根酶標記 IgG（1∶200）37℃孵育 2 h，DAB 顯色，金盤(pán)多媒體圖像處理系統測定陽(yáng)性條帶的積分吸光度值。

　　1.5 統計學(xué)方法

　　采用 SPSS 17.0 軟件包進(jìn)行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，對各組樣本進(jìn)行方差齊性檢驗，經(jīng)檢驗方差齊。將各組樣本進(jìn)行析因設計，單因素方差分析各處理因素主效應和交互效應，P<0.05 為差異有統計學(xué)意義。

　　2 結果

　　2.1 ECT和實(shí)驗藥物對 WKY 大鼠認知功能的影響

　　ECT 和實(shí)驗藥物（異丙酚和氯胺酮）均可造成認知障礙，即延長(cháng)逃避潛伏期（ECT：F=25.574，P=0.001；實(shí)驗藥物：F =11.125，P =0.003）、縮短空間探索時(shí)間（ECT：F =29.852，P =0.006；實(shí)驗藥物：F =21.193，P =0.001）；但兩者合用的影響呈相減效應，即 ECT 和實(shí)驗藥物合用之后，認知障礙程度反而減輕（逃避潛伏期：F=122.096，P=0.001；空間探索時(shí)間：F=113.536，P =0.012），見(jiàn)表 1、2。

　　2.2 ECT 和實(shí)驗藥物對 WKY 大鼠海馬中 Glu 含量的影響

　　ECT 可明顯增加海馬中神經(jīng)遞質(zhì) Glu 的濃度（F=275.182，P =0.005）；實(shí)驗藥物（異丙酚、氯胺酮）對海馬中神經(jīng)遞質(zhì) Glu 的濃度無(wú)明確影響（F =0.101，P =0.825）；ECT 和實(shí)驗藥物合用亦未見(jiàn)交互效應（F=0.402，P =0.712），見(jiàn)表 3。

　　2.3 ECT 和實(shí)驗藥物對 WKY 大鼠海馬組織神經(jīng)元中 Tau 蛋白表達的影響

　　ECT 和實(shí)驗藥物對海馬總 Tau 蛋白（Tau5 蛋白）的表達均無(wú)明顯影響（ECT：F =0.655，P =0.451；實(shí)驗藥物：F =0.041，P =0.935）；而且 ECT 和實(shí)驗藥物合用亦未見(jiàn)交互效應（F =0.134，P =0.651），見(jiàn)表 4 及附圖。

　　ECT 可增加海馬中磷酸化 Tau 蛋白的表達（p-PHF1Ser396/404：F=38.906，P =0.008；p-AT8Ser199/202：F =178.482，P =0.000；p-12E8Ser262：F =35.634，P =0.000）；實(shí)驗藥物可減少海馬中磷酸化 Tau 蛋白的表達（p-PHF1Ser396/404：F =63.825，P =0.000；p-AT8Ser199/202：F =74.813，P =0.009；p-12E8Ser262：F =101.340，P =0.000）；兩者合用的影響呈相減效應 （p-PHF1Ser396/404：F =5.264，P =0.014；p-AT8Ser199/202：F =44.712，P =0.001；p-12E8Ser262：F =50.714，P =0.005），即異丙酚和氯胺酮可使 ECT造成的海馬中磷酸化 Tau 蛋白表達增加的幅度降低。

　　3 討論

　　3.1 Tau 蛋白過(guò)磷酸化與認知及 Tau 蛋白過(guò)磷酸化的信號傳導機制

　　Tau 蛋白過(guò)度磷酸化可降低軸突轉運的效率，神經(jīng)信號傳遞的障礙及突觸退化，甚至造成神經(jīng)元凋亡或死亡，從而導致認知損害。本實(shí)驗證實(shí)，認知能力與 Tau 過(guò)度磷酸化有關(guān)，表現為 Tau 蛋白磷酸化程度愈高者認知能力越差。本實(shí)驗還發(fā)現，總 Tau蛋白的表達在神經(jīng)元 ECT 應激前后沒(méi)有明顯變化，在諸過(guò)度磷酸化位點(diǎn)中，Ser199/202 的磷酸化程度與 ECT 應激關(guān)系最為緊密，似乎在導致認知障礙的Tau 蛋白過(guò)度磷酸化機制中扮演主要角色。這可能與 Ser199/202 位點(diǎn)定位于微管結合區，其磷酸化參與調節 Tau 蛋白與微管的結合活性有關(guān)。

　　Tau 蛋白過(guò)度磷酸化的內源性機制是由于腦中Tau 蛋白自身的代謝異常導致的；Tau 蛋白過(guò)度磷酸化的外源性機制是蛋白激酶和蛋白磷酸酶的平衡失調引起的。GSK-3β 是一種多功能的絲氨酸 /蘇氨酸蛋白激酶，是目前發(fā)現最強有力的 Tau 蛋白激酶，催化 Tau 蛋白多個(gè)位點(diǎn)的磷酸化，其中包括Thr181、Ser199、Ser202、Thr205、Thr212、Thr217、Thr231、Ser396 和 Ser404。

　　本實(shí)驗中觀(guān)察到 ECT 后 Glu 在神經(jīng)元中的濃度明顯升高，與 WU 等發(fā)現應激可激活興奮性神經(jīng)傳遞系統誘導海馬 Tau 蛋白過(guò)磷酸化的研究結果一致。而 Glu 抑制包括 Akt 等多種蛋白激酶的活性，Akt 是 GSK-3β 的上游調節分子，而 GSK-3β 是使Tau 蛋白發(fā)生過(guò)度磷酸化的關(guān)鍵磷酸酶，故推測相關(guān)信號傳導途徑如下：ECT 應激導致 Glu 濃度升高→Akt 活性抑制→GSK-3β 活性升高→Tau 蛋白磷酸化程度增加。

　　3.2 興奮性氨基酸 Glu 與認知腦內 Glu 釋放過(guò)多，過(guò)度激動(dòng)膜電位依賴(lài)式GluR 導致 Ca2+大量?jì)攘?，激活? Ca2+敏感的各種酶類(lèi)，產(chǎn)生自由基激活磷酸肌醇環(huán)路，使神經(jīng)元變性，造成認知障礙。ECT 后認知障礙與 GluR 過(guò)度激動(dòng)引起氧化應激、導致海馬 LTP 飽和狀態(tài)、造成突觸可塑性障礙有關(guān)。NMDAR 的激動(dòng)可以通過(guò)激活GSK-3β、酪蛋白激酶 2 和肌動(dòng)蛋白聚合作用以增加 Tau 磷酸化程度，從而損傷神經(jīng)元；而 NMDAR 拮抗劑可從受體水平阻斷 Glu 的興奮性毒性，從而使得經(jīng)由 GSK-3β 增加 Tau 蛋白過(guò)度磷酸化程度的神經(jīng)損傷過(guò)程中斷。

　　本實(shí)驗結果表明，ECT 導致海馬中 Glu 濃度明顯上升，說(shuō)明 Glu 誘導的興奮性毒性很可能參與 ECT導致的認知功能障礙機制。實(shí)驗也表明，異丙酚和氯胺酮對海馬中神經(jīng)遞質(zhì) Glu 的濃度、海馬總 Tau 蛋白沒(méi)有明確影響，ECT 和實(shí)驗藥物合用亦未見(jiàn)交互效應，提示異丙酚和氯胺酮對海馬中 Tau 蛋白磷酸化的干預，不是通過(guò)影響海馬中 Glu 濃度發(fā)揮作用，其更可能是作為 GluR 的阻滯劑而阻斷海馬中Glu誘發(fā)的認知功能障礙。

　　3.3 氯胺酮緩解 ECT 后學(xué)習記憶障礙

　　本實(shí)驗發(fā)現鹽酸氯胺酮單獨使用，會(huì )導致認知減退，但與 ECT 合用則可明顯減輕 ECT 后的認知障礙。本實(shí)驗發(fā)現，鹽酸氯胺酮對減少海馬中 Glu 的濃度無(wú)明顯影響，但氯胺酮可以發(fā)揮類(lèi)似 GluR 拮抗劑的作用，明顯減輕興奮性毒性反應，并減緩 Tau 蛋白過(guò)度磷酸化程度，最終改善認知狀況。結合既往研究，推測其機制如下：氯胺酮屬于非競爭性 NMDA受體拮抗劑，與 NMDA 受體通道復合物的苯環(huán)己哌啶調節位點(diǎn)結合，通過(guò)變構調節來(lái)干擾興奮性氨基酸與 NMDA 受體的正常結合，減輕 NMDA 受體過(guò)度激活所致的氧自由基損傷。氯胺酮還可通過(guò)阻斷已開(kāi)放通道及降低通道，開(kāi)放頻率而阻滯 NM-DA 受體。本研究與 LOO 等的研究結論一致，LOO 認為鹽酸氯能夠減輕 ECT 后的認知功能障礙，尤其在 ECT 后的 1 周之內效果明顯。

　　3.4 異丙酚緩解 ECT 后學(xué)習記憶障礙

　　本實(shí)驗發(fā)現，異丙酚單獨使用會(huì )導致學(xué)習記憶減退，但與 ECT 合用則可明顯減輕 ECT 后的學(xué)習記憶障礙，這兩點(diǎn)與大多數研究一致。實(shí)驗發(fā)現無(wú)論施行 ECT 與否，異丙酚對海馬中 Glu 的濃度無(wú)明顯影響，但異丙酚與氯胺酮同樣具有類(lèi)似 GluR 阻滯劑的作用，減緩興奮性毒性誘發(fā)的 Tau 蛋白過(guò)度磷酸化進(jìn)程，改善 ECT 后的認知障礙。

　　結合既往研究，推測其機制如下：①異丙酚的苯環(huán)基團可作用于 NMDAR 的苯環(huán)己哌啶結合位點(diǎn)，非競爭性拮抗 NMDAR，縮短興奮性突觸后電位持續時(shí)間，減少因 NMDAR 過(guò)度興奮導致的神經(jīng)元損傷。②異丙酚還可通過(guò)升高 Akt 活性抑制神經(jīng)元凋亡。③異丙酚直接作為 NMDAR 阻滯劑而發(fā)揮作用，逆轉 ECT 后學(xué)習記憶障礙。