為了利用CRISPR-Cas9基因編輯系統切割基因，人們必需設計一種與靶基因的DNA相匹配的RNA序列。大多數基因具有上百個(gè)這樣的在基因組中的活性和獨特性上存在差異的序列。因此，尋找最佳的序列很難通過(guò)手工實(shí)現。一種新的“CrispRGold”程序有助科學(xué)家們鑒定出最為高效的和最為特異性的RNA序列。這種程序是由德國馬克斯-德?tīng)柌紖慰朔肿俞t學(xué)中心科學(xué)家Klaus Rajewsky教授領(lǐng)導的一個(gè)研究團隊開(kāi)發(fā)的。該團隊也開(kāi)發(fā)出一種新的已攜帶Cas9蛋白的模式小鼠。將這種模式小鼠和這些可靠的RNA序列結合在一起導致原代細胞中的基因高效地失活。這就使得研究人員能夠發(fā)現參與免疫細胞調節的新基因。

　　對很多分子生物學(xué)家而言，發(fā)現這種CRISPR-Cas9基因編輯系統代表著(zhù)研究上的一種新的里程碑：最終，基因組DNA能夠被高效地和高精準地切割，從而能夠讓基因失活、修飾或重新導入。

　　這僅需一種將Cas9酶帶到將被切割的DNA位點(diǎn)上的RNA片段。這種RNA片段被稱(chēng)作單向導RNA（sgRNA），含有長(cháng)20個(gè)堿基（A、U、C或G）的與基因組靶位點(diǎn)互補的序列。在此之前，科學(xué)家們不得不通過(guò)手工費力地選擇或者利用多種在線(xiàn)工具選擇sgRNA。在某些情形下，人們并不確定所選的sgRNA是否將Cas9酶攜帶到基因組上合適的位點(diǎn)或者一種類(lèi)似的但不是所想要的位點(diǎn)，以及這種sgRNA的效率是否比較高。

　　這種新的“CrispRGold”程序使得讓特定基因失去功能變得更加簡(jiǎn)單。它尋找確定的DNA靶序列以便鑒定出進(jìn)行切割的最佳位點(diǎn)并且提示一種在遺傳物質(zhì)上獨特的僅運送Cas9蛋白到所需位點(diǎn)上的sgRNA序列然后能夠切割靶基因以至于它不能夠發(fā)揮功能。這種程序是基于實(shí)驗數據和這些序列的獨特性和其他性質(zhì)而被開(kāi)發(fā)出來(lái)的。

　　通過(guò)與Van Trung Chu博士合作，來(lái)自Rajewsky教授領(lǐng)導的這個(gè)團隊的博士生Robin Graf在小鼠的B細胞中測試了這個(gè)系統。這些細胞不能夠在體外培養非常長(cháng)的時(shí)間，這是因為它們不會(huì )它們的自然環(huán)境外存活較長(cháng)的時(shí)間。因此，基因在很多B細胞中必需盡可能快地失活以便研究它們的功能。Chu通過(guò)培養一種產(chǎn)生大量的但是具有良好數量耐受性的Cas9蛋白的轉基因小鼠品系而實(shí)現這一點(diǎn)。

　　研究人員隨后從這些小鼠體內分離出B細胞，將單個(gè)基因特異性的sgRNA運送到這些細胞中。Graf說(shuō)，利用CrispRGold程序設計出的sgRNA在平均80%的這些細胞中高重復率地破壞這些靶基因?！霸谶@種類(lèi)型的低通量實(shí)驗中，高效率和低錯誤率是絕對必要的?！?/span>

　　研究人員利用他們的新方法鑒定出許多種之前未知的參與B細胞發(fā)育的基因。Graf說(shuō)，這種CrispRGold程序如今將被發(fā)布到網(wǎng)上，這樣它能夠被全世界的科學(xué)家們使用：“這種程序能夠輕松地用于來(lái)自一系列有機體中的其他類(lèi)型的細胞中。它也可能在臨床應用中具有重要意義---它將序列獨特性視為一種高度優(yōu)先因素，因而使得對潛在不想要的基因的修飾最小化，這也是在基因療法中必需不惜一切代價(jià)加以避免的?！?/span>