簡(jiǎn)介：周?chē)窠?jīng)損傷往往導致神經(jīng)再生受限或功能恢復不完全。在再生醫學(xué)領(lǐng)域，間充質(zhì)干細胞（間質(zhì)干細胞）由于具有分化成專(zhuān)門(mén)細胞的能力，被認為是細胞的貯存器。MSCS還可以分泌生物活性分子，幫助構建損傷后的再生微環(huán)境。鑒于這些特點(diǎn)，間充質(zhì)干細胞被認為是一種有希望的神經(jīng)損傷修復和再生工具。MSC療法的再生潛能由旁分泌作用介導。人臍帶間充質(zhì)干細胞（hucMSCs）產(chǎn)生的旁分泌效應比骨髓干細胞（bmcs）和脂肪源間充質(zhì)干細胞產(chǎn)生的旁分泌效應更為強烈。積累的證據表明，hucMSCs可促進(jìn)周?chē)窠?jīng)損傷后軸突的再生。郭等報道，hucMSCs移植通過(guò)旁分泌作用促進(jìn)周?chē)窠?jīng)修復的軸突再生和功能恢復。此外，hucMSCs還可以通過(guò)免疫抑制能力降低移植動(dòng)物模型的同種或異種免疫反應。因此，hucMSCs通過(guò)分泌可溶性因子，通過(guò)旁分泌機制增強和協(xié)助組織修復，在再生醫學(xué)中具有顯著(zhù)作用。細胞外囊泡（EVS）是近年來(lái)發(fā)現的間充質(zhì)干細胞旁分泌機制之一。EV包括外體、微泡和凋亡體，是由各種類(lèi)型的細胞（如干細胞）分泌的納米膜碎片。EVs 傳遞各種蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，細胞因子，轉錄因子和其他生物材料的目標細胞。它們對凍融過(guò)程有抵抗力，可以避免與骨髓間充質(zhì)干細胞移植相關(guān)的問(wèn)題，并且由于免疫原性低，可用于同種異體治療。MSC衍生EVs易于儲存，安全性高，在再生醫學(xué)中有著(zhù)顯著(zhù)的應用前景。最近對動(dòng)物模型的研究表明，EVs作為無(wú)細胞療法具有巨大的潛力。MSC-EV治療可增強缺血卒中大鼠的功能恢復，促進(jìn)軸突重塑、神經(jīng)發(fā)生和血管生成。用人骨髓基質(zhì)細胞衍生的EVs治療可改善中風(fēng)后神經(jīng)再生，并預防小鼠缺血后免疫抑制。我們以前的研究表明，BMSC衍生的EVs促進(jìn)了坐骨神經(jīng)擠壓損傷大鼠的神經(jīng)再生。然而，hUCMSC-EVs對坐骨神經(jīng)橫斷的影響仍有待研究。本研究建立了大鼠坐骨神經(jīng)橫斷模型。我們觀(guān)察到，hUCMSC-EVs可改善運動(dòng)功能恢復和神經(jīng)再生缺陷，減弱去神經(jīng)肌肉萎縮。hUCMSC-EVss可聚集到神經(jīng)缺損，下調促炎細胞因子（白細胞介素[IL]-6和IL-1β）和上調抗炎細胞因子（IL-10）。hUCMSC-EVs可能有助于坐骨神經(jīng)缺損大鼠的神經(jīng)再生。因此，hUCMSC-EVss是神經(jīng)切斷后神經(jīng)再生和周?chē)窠?jīng)損傷治療的一種非常有前景的策略。

　　材料和方法：3-4周齡、體重220-230克，雄性SD大鼠。hucMSCs的分離與表征：按照先前描述的方法分離和培養人臍帶間充質(zhì)干細胞（hucMSCs）。從第3到5代的hucMSCs用于本研究中進(jìn)行的實(shí)驗。如前所述進(jìn)行茜素紅和油紅O染色。這些試驗表明，hucMSCs具有成骨和成脂分化潛能。用藻紅蛋白（PE）結合的CD14、CD19、CD34、CD45、CD73和CD90抗體，通過(guò)流式細胞儀檢測不同通道hucMSCs的典型表面標志物。

　　hUCMSC-EVs的分離、純化和鑒定：人臍帶間充質(zhì)干細胞（hucMSCs）培養至80%-90%融合。如前所述，通過(guò)超速離心收集培養物的上清液，以分離EVs。采用BCA蛋白檢測試劑盒測定EVs的蛋白含量。使用Nanosight LM10系統評估hUCMSC-EVs的粒徑分布。如前所述，用透射電子顯微鏡（TEM）鑒定hUCMSC-EVs的形態(tài)。過(guò)濾后的EVs再懸浮在PBS中，培養并用20μL直接熒光抗體CD63染色，以檢測hUCMSC-EVs的典型表面標志物。未染色的EVs用作NCS。用bd-accuri-c6流式細胞儀分析EVS的表型。

　　外科手術(shù)和hUCMSC-EVs治療：大鼠腹腔注射10 mg/kg甲苯噻嗪和75 mg/kg氯胺酮。暴露并移除左側坐骨神經(jīng)（3 mm）。神經(jīng)收縮導致5毫米長(cháng)的間隙形成。通過(guò)神經(jīng)外膜和硅橡膠管，用簡(jiǎn)單的10-0尼龍直接縫合線(xiàn)連續固定近端和遠端。遠端和近端神經(jīng)殘端插入管內1 mm深。保持5 mm長(cháng)的間隙。筋膜和肌肉層用4-0尼龍縫線(xiàn)縫合。皮膚用連續的縫合線(xiàn)縫合。動(dòng)物模型誘導24小時(shí)后，將100μg hUCMSC-EVs（100μl）0.2 ml PBS或0.2 ml PBS注入大鼠尾靜脈。48只雄性SD大鼠被隨機分配到hUCMSC-EVs組（接受hUCMSC-EVs注射的大鼠，n=24）或對照組（接受PBS注射的大鼠，n=24）。三只未接受手術(shù)或治療的大鼠被指定為正常對照組。

　　功能評估：根據先前描述的方案，在手術(shù)前和神經(jīng)成形術(shù)后2、4、6和8周進(jìn)行行走軌跡分析。簡(jiǎn)單地說(shuō)，大鼠的后爪浸在黑色墨水中。然后讓大鼠在一張紙（30×7 cm）上展示一個(gè)標準的行走軌跡。坐骨神經(jīng)功能指數（SFI）根據以下公式計算：SFI=118.9（ETS-NTS）/NTS-51.2（EPL-NPL）/NPL-7.5。E和N分別代表實(shí)驗和正常；ETS代表實(shí)驗大鼠的第一到第五趾。NTS表示正常的腳趾伸展；EPL表示操作的實(shí)驗爪長(cháng)；NPL表示正常的爪長(cháng)。一般來(lái)說(shuō)，0對應于正常功能，而?100對應于功能的完全喪失。

　　肌肉重量測量：手術(shù)后8周大鼠安樂(lè )死。解剖腓腸肌，然后用電子天平稱(chēng)重。計算腓腸肌濕重比的公式為：手術(shù)側/正常側×100%。蘇木精和伊紅染色：采集大鼠的神經(jīng)導管和腓腸肌，4℃固定于4%PFA中，石蠟包埋。制備移植物中部的縱切面（厚度12μm）和橫截面（厚度4μm），并進(jìn)行蘇木精和伊紅（H&E）染色。免疫組化分析：神經(jīng)組織切片在損傷后3天進(jìn)行抗原回收。用1:200稀釋的單克隆抗IL-6抗體、1:500稀釋的單克隆抗IL-1β抗體或1:100稀釋的單克隆抗IL-10抗體封閉培養載玻片。用1:300稀釋的抗鼠IgG-辣根過(guò)氧化物酶培養載玻片。使用尼康Ti-S顯微鏡觀(guān)察圖像。使用Image‐Pro Plus軟件測定IL‐6、IL‐1β和IL‐10的平均密度。透射電子顯微鏡：術(shù)后4周切除修復神經(jīng)組織的中點(diǎn)進(jìn)行透射電鏡分析。如前所述，組織切片是通過(guò)透射電鏡制備和觀(guān)察的。計算了每個(gè)切片的髓鞘片層數目和髓鞘厚度。

　　免疫熒光：免疫熒光法測定神經(jīng)纖維形態(tài)和髓鞘再生。神經(jīng)組織石蠟切片用兔抗大鼠S-100（綠色）（1:100稀釋?zhuān)?、兔抗大鼠NF-200（紅色）（1:100稀釋?zhuān)?、兔抗大鼠髓鞘堿性蛋白（MBP）（綠色）（1:100稀釋?zhuān)┗蛐∈髥慰寺】笲rdu（紅色）（1:100稀釋?zhuān)┻M(jìn)行阻斷和標記。二抗采用Alexa Fluor 488山羊抗兔抗體（1:400稀釋?zhuān)┗駽y3山羊抗鼠抗體（1:300稀釋?zhuān)?。在?00倍放大下，通過(guò)計算10個(gè)隨機選擇的再生神經(jīng)組織切片中每個(gè)視野的髓鞘軸突數量來(lái)確定髓鞘再生。通過(guò)共聚焦顯微鏡分析，確定遠端神經(jīng)殘端的定向標記EV，以檢測特定的雪旺細胞（SC）標記S-100。切片用兔抗鼠S-100（綠色）（1:100稀釋?zhuān)┻M(jìn)行阻斷和標記，而Alexa Fluor 488山羊抗兔抗體（1:400稀釋?zhuān)┍挥米鞫?。hUCMSC-EVs的跟蹤：人臍帶MSC來(lái)源胞外囊泡（hUCMSC-EVs）懸浮液用DIR標記，通過(guò)超速離心重新懸浮，使溶液沉淀，用PBS洗滌兩次。將100μg DiR標記的 EVs靜脈注射到動(dòng)物模型中。注射后24小時(shí)，麻醉大鼠并進(jìn)行體內成像。利用IVIS光譜成像系統檢測大鼠標記 EVs的分布。

　　結果：hucMSCs和hUCMSC-EVs的典型特征：初始培養10天后，貼壁細胞呈長(cháng)紡錘狀，形成菌落，并達到融合狀態(tài)。如茜素紅和油紅O染色所示，間充質(zhì)干細胞表現出向骨細胞和脂肪細胞分化的多系潛能。熒光激活細胞分類(lèi)顯示，CD73和CD90的細胞呈陽(yáng)性，而CD14、CD19、CD34和CD45的細胞呈陰性。這些數據表明，根據國際細胞治療學(xué)會(huì )定義的標準，我們已經(jīng)有效地生成了hUCMSCs。通過(guò)透射電鏡、納米顆粒追蹤分析（NTA）和流式細胞術(shù)對分離純化的EV進(jìn)行評價(jià)。透射電鏡顯示，hUCMSC-EVs是具有典型杯狀形狀的圓形膜顆粒。hUCMSC-EVs的直徑范圍為80至650納米，NTA記錄的平均值為168納米。流式細胞術(shù)分析顯示，大多數人的hUCMSC-EVs表達特定標記CD63，這是EV的一個(gè)代表性標記。如上所述，hucMSCs及其相應的EV被成功地分離和表征。

　　hUCMSC-EVs治療改善了坐骨神經(jīng)的功能恢復：我們構建了一個(gè)大鼠坐骨神經(jīng)橫斷模型，以研究hUCMSC-EVs對坐骨神經(jīng)缺損的影響。圖2a說(shuō)明了RAT模型的構建以及hUCMSC-EVs的收集和處理。圖2b顯示了hUCMSC-EVs或PBS處理后的實(shí)驗過(guò)程示意圖。采用走行軌跡分析法評價(jià)大鼠運動(dòng)功能恢復情況。SFI用于揭示hUCMSC-EVs和對照組的改善程度。圖3a、b所示的行走軌跡分析結果表明，PBS組表現出神經(jīng)功能恢復，hUCMSC-EVs治療組表現出功能恢復的改善。坐骨神經(jīng)橫斷8周后，hUCMSC-EVs治療大鼠的行走軌跡與正常大鼠幾乎相似。術(shù)后4周、6周和8周，與對照組相比，hUCMSC-EVs組的SFI評分顯著(zhù)增加。這些結果表明，應用hUCMSC-EVs治療可以改善坐骨神經(jīng)切斷后的運動(dòng)功能恢復。

　　神經(jīng)再生的形態(tài)學(xué)分析：我們觀(guān)察了坐骨神經(jīng)橫斷8周后中段再生神經(jīng)的形態(tài)。導管被完全切除，切除的正中神經(jīng)的兩段被連接起來(lái)。結果表明，hUCMSC-EVs和對照組均表現為神經(jīng)生成。實(shí)驗組大鼠再生神經(jīng)比對照組大。具體來(lái)說(shuō)，H&E染色顯示hUCMSC-EVs組再生神經(jīng)纖維的直徑明顯大于對照組。S‐100是SCS的表面標志物，它包裹神經(jīng)纖維形成髓鞘。免疫熒光染色顯示，在hUCMSC-EVs和對照組中出現S-100陽(yáng)性纖維。然而，hUCMSC-EVs組s-100陽(yáng)性纖維的免疫熒光密度高于對照組。Brdu染色結果表明，hUCMSC-EVs處理促進(jìn)了雪旺細胞的增殖。hUCMSC-EVs治療組術(shù)后8周軸突再生優(yōu)于對照組。這一結果表明，hUCMSC-EVs可促進(jìn)受損坐骨神經(jīng)再髓鞘化和軸突再生。

　　人臍帶MSC來(lái)源胞外囊泡增加了有髓纖維的總數：通過(guò)免疫熒光分析，獲得了用于檢測髓鞘再生的橫切面中點(diǎn)。圖5a顯示了修復神經(jīng)組織的中點(diǎn)。術(shù)后8周，我們進(jìn)行免疫染色，以檢測再生坐骨神經(jīng)橫截面中軸突標記物NF-200和SC標記物MBP的存在。如圖5b所示，NF-200和MBP的熒光信號主要在hUCMSC-EVs組的切片中檢測到，而在對照組的切片中檢測到的信號很少或沒(méi)有。量化坐骨神經(jīng)有髓鞘軸突顯示，hUCMSC-EVs治療可增加軸突切除后8周的軸突髓鞘形成。此外，在術(shù)后4周，與PBS對照組相比，hUCMSC-EVs治療組的MBP表達上調。透射電鏡顯示，hUCMSC-EVs處理的大鼠髓鞘纖維數量和髓鞘厚度高于PBS處理的大鼠。這些發(fā)現表明，hUCMSC-EVs治療導致大量軸突和個(gè)別軸突周?chē)膸讉€(gè)SCs的產(chǎn)生，并提示hUCMSC-EVs可能促進(jìn)再生軸突的髓鞘化。

　　人臍帶MSC來(lái)源胞外囊泡降低了腓腸肌萎縮的程度：坐骨神經(jīng)橫斷后腓腸肌因未接受神經(jīng)支配而減重。我們在8周時(shí)對腓腸肌進(jìn)行稱(chēng)重，以評估肌肉神經(jīng)支配恢復情況。hUCMSC-EVs組腓腸肌濕重高于對照組。此外，hUCMSC-EVs組腓腸肌濕重比高于對照組。這些結果表明，hUCMSC-EVs治療導致腓腸肌廣泛的神經(jīng)支配。H&E染色顯示，hUCMSC-EVs組腓腸肌纖維萎縮減弱。hUCMSC-EVs組腓腸肌纖維形態(tài)與正常肌肉相似。然而，對照組腓腸肌纖維面積縮小，提示有嚴重的腓腸肌萎縮。

　　人臍帶MSC來(lái)源胞外囊泡聚集到大鼠神經(jīng)缺損并調節其炎癥反應：間充質(zhì)干細胞（MSCs）可以在損傷組織中存活并嫁接。因此，我們研究了來(lái)源EV的MSC是否具有相似的歸巢功能。我們用IVIS lumina II系統通過(guò)熒光成像評估了EVS在大鼠體內的生物分布。注射到大鼠尾靜脈后24小時(shí)，來(lái)自HUCMSC的DiR標記EV聚集到神經(jīng)缺損。立即處死大鼠，采集神經(jīng)缺損遠端的神經(jīng)進(jìn)行組織切片?？v向切片的免疫熒光染色結果顯示，DiR標記的EV到達神經(jīng)缺損的遠端。有證據表明，MSC-EVS限制了導致缺血性腦損傷的缺血后炎癥，我們還研究了神經(jīng)損傷誘導的免疫反應是否由hUCMSC-EVs調節。術(shù)后3天對遠端神經(jīng)殘端進(jìn)行組織化學(xué)染色。與對照組相比，hUCMSC-EVs治療組促下調炎細胞因子（IL-6和IL-1β），上調抗炎細胞因子（IL-10）。這些結果表明，hUCMSC-EVs可以植入神經(jīng)缺損并調節其炎癥反應。這種作用可能促進(jìn)缺陷神經(jīng)的再生。

　　結論：證明hUCMSC-EVs可有效促進(jìn)坐骨神經(jīng)缺損大鼠模型的功能恢復和神經(jīng)再生。我們的研究為臨床周?chē)窠?jīng)修復提供了可能。與干細胞給藥相比，hUCMSC-EVs的臨床應用更為有利。