肝性腦病(hepatic encephalopathy,  HE)是由肝功能不全和/或門(mén)體靜脈分流(portal systemic shunting, PSS)所引起的大腦功能障礙，其神經(jīng)或心理異常表現程度各異，輕者為亞臨床改變，重者可發(fā)生昏迷。HE分為3種類(lèi)型;A型HF為與急性肝功能衰竭相關(guān)的HF;Y型HE為單純門(mén)體旁路所引起;C型HE是在慢性肝病患者中發(fā)生的HF，患者通常己進(jìn)展至肝硬化，并建立了較為豐富的門(mén)體側支循環(huán)州?，F就模型建立方法、機制、優(yōu)缺點(diǎn)和行為學(xué)檢測等方面對三型HE的常用動(dòng)物模型作一綜述。

　　一、A型HE動(dòng)物模型

　　(一)非肝性動(dòng)物模型

　　建模方法可采用肝斷流手術(shù)或全肝臟切除術(shù)。肝斷流手術(shù)中，肝臟被完整保留，但流入肝臟的血循環(huán)被轉道(門(mén)腔靜脈吻合)和阻斷(肝動(dòng)脈結扎);全肝臟切除術(shù)中肝臟被移除，內臟血循環(huán)轉道。機制為通過(guò)切除肝臟或擾亂肝臟的血液循環(huán)造成肝功能衰竭。肝切除模型和肝斷流模型大鼠均會(huì )出現星型膠質(zhì)細胞足突腫脹，肝斷流術(shù)后的大鼠腦水腫、血氨升高、顱內壓增高、其腦動(dòng)作電位的表現和急性肝衰竭(acute liverfailure, ALF)患者的表現相似。由于21h死亡率較高，不利于療效的觀(guān)察，從而限制了這些模型的應用。

　　(二)藥物誘導模型

　　1.硫代乙酞胺(Thioacctamidc,  TAA)誘導的鼠模型:TAA誘導的ALF大鼠模型最早由Gimmcrmann等建立。不同文獻選用的實(shí)驗動(dòng)物、TAA劑量和給藥時(shí)間有所不同，如Sprague Dawlcy（SD)大鼠連續1天300 mg/ kg腹腔注射，雌性C69BZ,/6小鼠連續2天300 mg/kg腹腔注射，或小鼠連續3天100 mg/kg腹腔注射州等。TAA被肝臟攝取后，經(jīng)肝細胞內的細胞色素P 150混合功能氧化酶代謝為T(mén)AA-硫氧化物，引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應和肝細胞損傷，并可直接作用于肝細胞DNA,RNA和蛋白質(zhì)合成酶產(chǎn)生毒性作用，誘導肝代謝紊亂，致肝壞死。 TAA制備的HF模型具有良好的可重復性、易操作、成功率高、與人類(lèi)HF相似度高等優(yōu)點(diǎn)。

　　2.四氯化碳誘導的鼠模型:將CCl4按l：4體積比溶于礦物油，按2. 5  mL/kg劑量給予BALB/c裸鼠腹腔注射。CCl.經(jīng)肝微粒體細胞色素P 150代謝激活，生成活自由基及一系列氧化活性物質(zhì)，與肝細胞質(zhì)膜或亞細胞膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應，降解膜磷脂，破壞細胞膜完整性，使其通透性增加，致肝細胞壞死訓。CCl.價(jià)格低廉;但實(shí)驗動(dòng)物存活率低(24和48 h存活率分別為40%和10%)。

　　3.D-氨基半乳糖誘導的兔子模型:該模型的建立方法為D-Ual N溶于500濃度的右旋糖溶液，按I. 25 mmol/kg的劑量予以雄性新西蘭白兔耳靜脈注射。星形膠質(zhì)細胞的損傷和功能受抑制是該模型HF的發(fā)生機制。該模型可以重現星型膠質(zhì)細胞水腫，但實(shí)驗動(dòng)物相對較貴。

　　4.脂多糖和a鵝膏草堿誘導的稱(chēng)猴模型:將1 ug/kg脂多糖和0. 1 mg/kg a鵝膏草堿溶于50 mI.的生理鹽水之中，緩慢注射到雌性恒河猴的腹腔中。脂多糖和a-鎢膏草堿先引起恒河猴肝細胞脂肪變性，最后發(fā)展成肝細胞大片壞死，爆發(fā)性肝功能衰竭。恒河猴模型與人類(lèi)HF有相似的代謝和生理學(xué)特點(diǎn)。但價(jià)格昂貴;迄今為止研究例數少，缺乏對比。

　　5.氧化偶氮甲烷誘導的小鼠模型:雄性C69B1/6大鼠腹腔注射100 mg/kg AOM。AOM促進(jìn)趨化因子配體2 ( chcmokinc ligand 2 , CCL2)上調，CCL2與肝性腦病小膠質(zhì)細胞的激活和神經(jīng)功能下降相關(guān)。該模型是研究急性肝損傷和肝性腦病的理想模型，具有可逆性、可重復性、具有治療窗等;但AOM對人體有生物毒性，實(shí)驗中還需注意對動(dòng)物的體溫控制。

　　二、H型HE動(dòng)物模型

　　目前常用的建模方法是端一側門(mén)腔靜脈吻合術(shù)(porta-caval anastomosis, PCA):結扎門(mén)靜脈近端，將門(mén)靜脈和下腔靜脈之間進(jìn)行端一側吻合。門(mén)腔靜脈分流引起腦組織中氨和谷氨酞胺增高，改變晝夜生物節律，使運動(dòng)功能、記憶和學(xué)習能力減退，反射下降，降低腦的葡萄糖利用率，改變多種神經(jīng)遞質(zhì)功能訓。改良的選擇性門(mén)腔靜脈端側吻合術(shù)是將腸系膜上靜脈和下腔靜脈行端一側吻合。選擇性門(mén)腔靜脈端鋇吻合術(shù)與側門(mén)腔靜脈吻合使流入肝臟的門(mén)靜脈血流全部相比，只減少了其中的50門(mén)靜脈血流;且術(shù)中靜脈更易暴露被找到，但為了確保血管不被拉伸和卷曲所花費的手術(shù)時(shí)間更長(cháng)。

　　三、L型HE動(dòng)物模型

　　(一)有癥狀的C型HE模型

　　1.藥物誘導模型:予以含TAA(初始濃度0.03%)的飲用水喂養Wistar大鼠12周，每周根據大鼠的體質(zhì)量適當增減TAA的濃度沙從或20周(濃度0. 3 g/L或0. 5 g/L)。發(fā)病機制是通過(guò)改變在注意力和記憶力中起作用的腦邊緣系統區的乙酞膽堿脂酶活性。 TAA價(jià)格低廉;但藥物誘導的C型HE模型建模周期較長(cháng)，建模過(guò)程中需注意監控動(dòng)物體質(zhì)量，適當增減藥物劑量。

　　2.手術(shù)模型:在麻醉卜結扎成年Wistar大鼠肝膽管匯合處以下和胰管開(kāi)口以上的膽總管處，再將兩結扎處之間的膽總管切除。膽管結扎(bile duct ligated, BDI.)大鼠大腦皮質(zhì)中GABA神經(jīng)遞質(zhì)的合成改變，表現為自主活動(dòng)的時(shí)空特點(diǎn)和探索性活動(dòng)的改變，和短期識別記憶力的下降。BDL可誘導可重復的膽汁性肝硬化大鼠模型，表現為肝功能衰竭、進(jìn)行性黃疽、門(mén)脈高壓、門(mén)體分流、細菌移位以及免疫系統功能障礙;該模型大鼠雖然血氨升高，但僅表現為低級別的HE。

　　3.藥物和手術(shù)結合的C型HF模型

　?。?) BDL并輔以銨鹽喂食的大鼠模型:給予BDL術(shù)后的SD大鼠連續兩周喂食含質(zhì)量百分比濃度為10%的乙酸銨的食物。大鼠在肝病疾病和炎癥介質(zhì)激活的背景下，氨作為誘發(fā)因素，引起嚴重的行為損傷。大鼠表現出與肝硬化HF患者相似的神經(jīng)解剖學(xué)和神經(jīng)化學(xué)特點(diǎn)，腦水腫和炎癥激活可以在這種情況卜被發(fā)現。

　　(2)CCl.誘導肝硬化結合門(mén)靜脈結扎的大鼠模型:SD雄性大鼠每周予以含CCl.的飲用水灌胃，初始劑量為20ul，以后每周根據體質(zhì)量調整劑量，共6周;其后實(shí)施門(mén)靜脈結扎術(shù)。大鼠有輕度的腦水腫，肝再生結節和Alzheimer型星形細胞。該模型大鼠比肝硬化模型大鼠門(mén)體分流更明顯;同時(shí)比門(mén)靜脈結扎大鼠肝功能異常更明顯。能很好地重現肝硬化HF患者的主要癥狀:門(mén)體分流、血氨和腦氨水平增高、輕度腦水腫。缺點(diǎn)在于死亡率較高。

　　(二)MHF的模型

　　1.藥物誘導模型:SI)雄性大鼠予以200 mg/kg TAA隔口腹腔注射，共兩次，MHF發(fā)生率為83.3%?；蛐坌詀lbino大鼠予以50 mg/kg TAA腹腔注射，每周兩次，共14d或SI)大鼠予以200 mg/kg TAA腹腔注射，每周兩次，連續8周。谷氨酸鹽一氧化氮不鳥(niǎo)酸葺通路中多巴胺受抑制導致MHF大鼠的記憶受損為其發(fā)病機制。需通過(guò)腦誘發(fā)電位檢查是否建模成功。

　　2.手術(shù)模型:采用門(mén)靜脈校準狹窄術(shù):雄性Wistar Kyoto大鼠在乙醚麻醉下，予以20號鈍針頭在門(mén)靜脈旁引導，用3號絲線(xiàn)結扎門(mén)靜脈;隨后移除針頭得到一個(gè)校準狹窄的門(mén)靜脈;通過(guò)門(mén)靜脈校準狹窄術(shù)大約能減少門(mén)靜脈66%的容積。術(shù)后10 d發(fā)生門(mén)靜脈高壓和高血氨癥，不伴有其他明顯的中樞神經(jīng)系統改變，其分子學(xué)機制可能與海馬線(xiàn)粒體功能障礙和細胞凋亡有關(guān)。該模型可以重現MHF高血氨的癥狀，但需精準地控制門(mén)靜脈的狹窄度，對于實(shí)驗者的手術(shù)技術(shù)要求較高。

　　四、HF模型行為學(xué)檢測方法

　　(一)強制游泳試驗實(shí)驗前1天，大鼠在室溫下，被放置在直徑21 cm，高50 cm的圓柱桶內，注入30 cm深的水，讓大鼠在其中活動(dòng)10 min，將大鼠從桶中取出，在干凈的籠中干燥后放回飼養籠。24 h后，大鼠被再次放置在圓柱筒內，用攝像機監測大鼠5min的行為，并計算大鼠不運動(dòng)、游泳或試圖爬出圓筒這三項活動(dòng)每項所用的時(shí)間。

　　(二)新物體識別實(shí)驗第一天，大鼠被放置在直徑80 cm的圓形場(chǎng)地5min以適應環(huán)境。第二天，在同一場(chǎng)地里放置兩個(gè)相同的物品，讓大鼠自由探索2 min。第三天，將其中一個(gè)物品替換成不一樣的物品，讓大鼠自由探索2 min，記錄其探索兩個(gè)物品的時(shí)間，并計算探索新物品的時(shí)間與探索兩個(gè)物品時(shí)間的比值，比值下降表示其記憶能力受損。

　　(三)空間參考記憶的Morris水迷宮實(shí)驗該實(shí)驗在圓形的水箱中進(jìn)行。大鼠會(huì )經(jīng)過(guò)連續四天的訓練，將它們依次放入水中，給予其120s時(shí)間尋找平臺，并在平臺上停留20 s。第五天，將平臺移開(kāi)，每只大鼠進(jìn)行四次實(shí)驗，每次有90s的時(shí)間游泳，在原先平臺處停留的平均時(shí)間記錄為記憶再現指數。

　　(四)旋轉實(shí)驗每只大鼠將進(jìn)行每天5輪連續5d的旋轉實(shí)驗。大鼠被放置在一個(gè)轉棒裝置上，轉棒的速度從第一天到第五天分別為5,10,15,20和25 rpm。每輪實(shí)驗會(huì )進(jìn)行三

　　次，每次間隔10 min，記錄三次實(shí)驗中大鼠在轉輪上停留的最長(cháng)時(shí)間。

　　(五)步態(tài)實(shí)驗大鼠的后爪被涂上墨水，在60 cm X 10 cm紙帶上從光亮處走向黑暗處，測量并記錄左右爪之間的距離。

　　(六)穿梭箱回避實(shí)驗大鼠被放置在一個(gè)雙向的穿梭箱中，內有設備可以產(chǎn)生非條件刺激C unconditioned  stimulus,US)和條件刺激(conditioned stimulus, CS，電擊后亮燈)。每只大鼠在連續五天中接受五輪測試，每輪測試前，給大鼠5 min適應暗室，隨后進(jìn)行30次試驗，每?jì)纱伍g隔(30士5) s。CS中每次電擊前有20s電燈點(diǎn)亮時(shí)間。US中，相當于CS的最后10s時(shí)會(huì )以0. 5 mA電流電擊大鼠10s或至大鼠移動(dòng)到箱子的另一側即停。如果大鼠在CS中受到電擊前即移動(dòng)到箱子另一側，則此次記錄為回避;如果大鼠受到刺激后做出反應，則記錄為逃脫;如果大鼠在刺激中不移至另一側，則記錄為無(wú)反應。分別記錄大鼠回避、逃脫和無(wú)反應的次數。

　　(七)高架十字迷宮實(shí)驗高架十字迷宮組件由兩條相對開(kāi)放臂50 cm長(cháng)*10cm寬)和兩條相對閉合臂50 cm長(cháng)X10cm寬X 40 cm高)組成。裝置距離地面50 cm高，放置在紅光照明的房間正中。大鼠被放在裝備的中央，面向開(kāi)放臂，自由探索5 min。分別記錄大鼠進(jìn)入封閉臂的次數與進(jìn)入兩組臂總次數的比值、于封閉臂處滯留時(shí)間與在兩組臂處滯留總時(shí)間的比值。

　　(八)動(dòng)物表現的臨床分級評分標準正常行為((0分)，輕度嗜睡((1分)，運動(dòng)減少、姿勢控制困難和疼痛知覺(jué)減弱(2分)，嚴重的共濟失調、無(wú)自發(fā)翻正反射(3分)，無(wú)翻正反射、對疼痛刺激無(wú)反應((}分)川。

　　五、結語(yǔ)

　　A型HE模型的建立期望達到如下標準:可復制性，并易于觀(guān)察分期;癥狀的進(jìn)展包括腦水腫及其并發(fā)癥(顱內高壓及腦廟);潛在的可逆轉性;高血氨/腦氨、谷氨酞胺增加;肝臟、腦組織的病理變化具有特征性;對實(shí)驗人員具有最小的毒性。H和C型HE大鼠模型期望達到的標準為:門(mén)體分流或慢性肝病伴門(mén)體分流;腦病的癥狀從輕微型HF到昏迷;腦病昏迷階段Alzheimer型星形細胞增生;rfn.氨、腦氨和谷氨酞胺濃度升高;存在誘發(fā)因素;對治療手段有可觀(guān)察的臨床反應。根據研究目的合理選擇并進(jìn)一步完善合適且穩定的HE動(dòng)物模型對于進(jìn)一步闡明HF的發(fā)病機制和尋求新的治療方法十分重要。