小鼠和大鼠可謂是生命科學(xué)實(shí)驗室里的明星，成功的小鼠和大鼠模型可謂是“生命科學(xué)的好幫手”。很多人可能想自己設計或是了解條件性基因敲除小鼠，在此做個(gè)小結，供大家參考。

　　條件性基因敲除小鼠的設計利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。它們都是位點(diǎn)特異性重組酶系統。這里以Cre/LoxP系統為例。比如在待敲除的一段目標DNA序列的兩端各放置一個(gè)loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。將flox小鼠與帶有細胞特異性表達Cre的小鼠交配繁殖，以獲得在特定細胞里把目標基因敲除掉的小鼠，即條件性基因敲除小鼠。此外，若與控制Cre表達的其他誘導系統(比如CreERT2)相結合，還可以對某一基因同時(shí)實(shí)現時(shí)空兩方面的調控。

　　Cre/loxP系統來(lái)源于噬菌體，可以介導位點(diǎn)特異的DNA重組。該系統含有兩個(gè)組成成分：一個(gè)是一段長(cháng)34bp的DNA序列(LoxP序列)，含有兩個(gè)13 bp的反向重復序列和一個(gè)8 bp的核心序列。 LoxP的方向由中間這8個(gè)堿基決定。這段LoxP序列是Cre重組酶識別的位點(diǎn)。 令一個(gè)組成部分是Cre重組酶。它是由噬菌體編碼的一種由343個(gè)氨基酸組成的蛋白。Cre可以介導兩個(gè)LoxP位點(diǎn)的重組，從而引起兩個(gè)LoxP之間DNA序列的缺失。如果將Cre重組酶cDNA通過(guò)基因工程的手段置于組織或細胞特異性啟動(dòng)子之下，可以得到Cre組織/細胞特異性表達的Cre小鼠，也叫Cre工具小鼠。 跟Flox小鼠交配之后，可以得到條件性基因敲除小鼠。

　　所謂Flox小鼠是指在某個(gè)基因的某個(gè)外顯子兩側各放一個(gè)LoxP序列。這段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。這種Flox小鼠一般要通過(guò)設計構建打靶載體、胚胎干細胞重組、囊胚顯微注射、和嵌合體小鼠傳代來(lái)獲得。這種小鼠跟Cre工具小鼠交配，由于Cre的表達，介導兩個(gè)LoxP位點(diǎn)序列的重組，從而敲除兩個(gè)LoxP之間的序列。由于不同Cre工具小鼠的Cre表達有組織/細胞特異性，就可以達到在不同組織、細胞里特異性敲除目的基因的目標。比如上皮細胞、胸腺細胞、T細胞、B細胞、心肌細胞、腸道、肺臟等。

　　那如何設計條件性基因敲除小鼠呢?這里所說(shuō)的設計主要是Flox小鼠的設計。所謂條件性敲除，是說(shuō)除了特定細胞外，其它細胞里面沒(méi)有任何的基因表達異常。一般情況下，不要在第一個(gè)外顯子前面放置LoxP序列。因為第一個(gè)外顯子前面一般是啟動(dòng)子。放置LoxP序列有可能會(huì )破壞或改變啟動(dòng)子活性。條件性敲除一般是敲掉最早引起移碼突變的外顯子。這樣的話(huà)，最好不要敲除有起始密碼子ATG的外顯子。否則的話(huà)，基因可能會(huì )利用ORF內的ATG編碼一個(gè)缺少部分N端序列的蛋白，這個(gè)蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能。在選擇要敲除的外顯子的時(shí)候(各放一個(gè)LoxP在一個(gè)外顯子的兩側)，該外顯子的堿基數目不能是3N，否則新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能產(chǎn)生移碼突變。會(huì )產(chǎn)生一個(gè)與野生蛋白相比少了一段中間序列的新蛋白。如果一個(gè)外顯子的堿基數目是3N+1或3N+2，敲除這個(gè)外顯子之后會(huì )產(chǎn)生移碼突變，就可以達到基因敲除的目的。篩選要敲除(Floxed)的外顯子的時(shí)候，一般是從最上游的外顯子開(kāi)始篩選適合敲除的外顯子。需要注意的是，一般的dna分析軟件不能確定內含子和外顯子的邊界，需要仔細核對。95%以上的邊界遵循gt/ag邊界原則。也可以在Ensembl上查一個(gè)基因的外顯子和內含子。這個(gè)網(wǎng)站上的結果絕大部分是正確的。但也需要仔細核對。畢竟基因敲除小鼠研發(fā)是一個(gè)時(shí)間比較長(cháng)的過(guò)程，需要特別小心。前期做多少的考慮都不嫌多。這些原則只是對一般課題的考慮。特殊情況需要特殊處理。比如，如果只是想敲除一個(gè)基因的某個(gè)特定domain，或是如果一個(gè)基因有一個(gè)很大的外顯子，這個(gè)時(shí)候即使這個(gè)外顯子的堿基數目是3N，也可以對其進(jìn)行敲除。