某些標記探針必須經(jīng)純化后方可使用。這是因為在探針標記過(guò)程中,反應液中仍存在一些未被結合到探針中去的剩余dNTP等小分子。
為將摻入并結合到cDNA,cRNA和標記寡核苷酸與游離的標記寡核苷酸分開(kāi),常使用乙醇沉淀法或酚/氯仿抽提法進(jìn)行純化。
乙醇沉淀法的原理是:DNA可被乙醇沉淀,而未摻入DNA的dNTP則保留在上清液中,由此反復乙醇沉淀能將兩者分開(kāi)。
核酸溶液中去除蛋白質(zhì)的酚/氯仿抽提法的原理是:交替使用酚,氯仿這兩種不同的蛋白質(zhì)變性劑,以增加去除蛋白質(zhì)雜質(zhì)的效果。
因為酚雖能有效地變性蛋白質(zhì),但它不能完全抑制RNA酶的活性,而且酚能溶解10-15% 的水,從而溶解一部分ploy(A)RNA。
為克服這兩方面的局限,混合使用酚與氯仿,對于RNA提取,顯得更加重要,氯仿還能加速有機相與液相分層,去除植物色素和蔗糖。
(本文轉載網(wǎng)絡(luò ))