NA標記是將標記物(如放射性同位素、熒光素或酶)共價(jià)地連接到RNA,通過(guò)檢測標記物,進(jìn)而實(shí)現對RNA鑒別和檢測的目的。RNA標記在分子探針領(lǐng)域應用廣泛,在疾病診斷方面也很有前景。
理想的RNA標記方法應符合以下要求:
1. 操作簡(jiǎn)單,靈敏度高
2. 不影響堿基配對的特異性
3. 不影響RNA活性
4. 對酶促反應活性無(wú)影響或影響不大
5. 檢測方法具有高度靈敏性和高度特異性
6. 標記物對人體無(wú)害
RNA標記方法:
按反應機制分如下四類(lèi):直接標記法,加尾標記法,基于逆轉錄反應的標記方法,基于RNA克隆擴增的標記方法。
常用于RNA標記的方法按標記物性質(zhì)分為:
放射性同位素標記:32P、35S、3H
非放射性標記:半抗原熒光素化學(xué)發(fā)光物質(zhì)
地高辛
地高辛標記RNA常用的方法是將DIG與UTP共價(jià)結合形成DIG-UTP,以DIG-UTP、ATP、CTP、GTP為底物通過(guò)RNA聚合酶T7、SP6經(jīng)體外轉錄合成標記RNA。此法多用于RNA探針的制備,一般每20~25個(gè)核苷酸可引入一個(gè)地高辛分子。5'末端標記法5'末端標記法是通過(guò)化學(xué)方法將地高辛標記于寡核苷酸的5'末端。首先在5'末端連接上一個(gè)氨基連接臂殘基,將合成的寡核苷酸純化后,再使DIG-NHS與5'末端的氨基殘基發(fā)生共價(jià)結合,從而形成標記RNA。DIG-RNA5'3'5'3'DIGAnti-DIG-APAP-DIG-RNA5'3'5'3'X光片曝光化學(xué)發(fā)光信號藍紫色
生物素
用生物素標記RNA的方法常見(jiàn)的是用生物素與UTP結合形成Biotin-UTP,以Biotin-UTPATP、CTP、GTP為底物通過(guò)RNA聚合酶SP6、T7等經(jīng)體外轉錄合成標記RNA。
熒光素
目前常見(jiàn)的熒光染料包括:異硫氰酸熒光素(FITC)四甲基異硫氰酸羅丹明四乙基羅丹明得克薩斯紅藻紅蛋白(PE)花青類(lèi)染料(Cy3、Cy5)新型熒光素如量子點(diǎn)(半導體納米晶體)。