引物（primers）：

 引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個(gè)引物與感興趣區域一端的一條DNA模板鏈互補，另一個(gè)引物與感興趣區域另一端的另一條DNA模板鏈互補。引物的重要性：在整個(gè)PCR體系中，引物占有十分重要的地位。
 

引物的重要性：

 在整個(gè)PCR體系中， 引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結合，不與其他非目的DNA結合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對引物進(jìn)行有效的延伸，可見(jiàn)引物設計好壞與PCR結果密切相關(guān)。
 

引物設計原則：

1.  引物長(cháng)度

   一般為15-30個(gè)核苷酸，在做長(cháng)片段PCR或做某些特殊的PCR時(shí)應使用較長(cháng)的引物，但最多不超過(guò)50個(gè)核苷酸。
 

2.  堿基分布的均衡性

   同一堿基連續出現不應超過(guò)5個(gè)；GC含量一般40-60%；GC含量太低導致引物Tm值較低，使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性；GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴增。
 

3.  引物Tm值

   一般要求：55℃~65℃。

計算：

對于低于20個(gè)堿基的引物，Tm值可根據Tm=4（G C） 2（A T）來(lái)粗略估算；

對于較長(cháng)引物，Tm值則需要考慮熱動(dòng)力學(xué)參數，從“最近鄰位”的計算方式得到，這也是現有的引物設計軟件最常用的計算方式。

Tm = △H/（△ S R * ln （C/4）） 16.6 log （[K ]/（1 0.7 [K ]）） - 273.15

引物二級結構：

引物二聚體，盡可能避免兩個(gè)引物分子之間3’端有有較多堿基互補。

發(fā)夾結構：

尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結構，否則將嚴重影響DNA聚合酶的延伸。
 

引物3’端：

引物的延伸從3’端開(kāi)始，因此3’端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴格配對，不能進(jìn)行任何修飾，否則不能進(jìn)行有效的延伸，甚至導致PCR擴增完全失敗?？紤]到密碼子的簡(jiǎn)并性，引物3’端最后一個(gè)堿基最好不與密碼子第三個(gè)堿基配對。
 

引物5’端：

引物5’端可以有與模板DNA不配對堿基，在5’端引入一段非模板依賴(lài)性序列。

5’端加上限制性核酸內切酶位點(diǎn)序列（酶切位點(diǎn)5’端加上適當數量的保護堿基）。

5’端的某一位點(diǎn)修改某個(gè)堿基，人為地在產(chǎn)物中引入該位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究。

5’端標記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如生物素、地高辛等）。
 

引物的內部穩定性：

過(guò)去認為，引物3’端應牢牢結合在模板上才能有效地進(jìn)行延伸，故3’端最好為G或C。

現在的觀(guān)點(diǎn)認為，引物的5’端應是相對穩定結構，而3’端在堿基配對的情況下最好為低穩定性結構，即3’端盡可能選用A或T，少用G或C。

僅僅3’端幾個(gè)堿基與非特異位點(diǎn)上的堿基形成的低穩定性結構是難以有效引發(fā)引物延伸的。

如果3’端為富含G、C的結構，只需3’端幾個(gè)堿基與模板互補結合，就可能引發(fā)延伸，造成假引發(fā)。

引物的保守性與特異性

保守性：通用引物——檢測同一類(lèi)病原微生物盡可能多的型別；

特異性：避免非特異性擴增。