為了獲得高質(zhì)量的真核細胞mRNA， 必須使用RNA酶的抑制劑或采用下述的破碎細胞和滅活RNA酶同步進(jìn)行的方法，最大限度地降低細胞破碎過(guò)程中所釋放的RNA酶的活性。同時(shí)，避免偶然引入實(shí)驗室內其他潛在的痕量RNA酶也很重要。下面列舉避免RNA酶法染問(wèn)題的一些注意事項。大多數有經(jīng)驗的研究者并不拘泥于這些注意事項，只是在遇到問(wèn)題時(shí)可能采用其中的一種或幾種方法加以解決。
實(shí)驗程序
RNA
酶的抑制劑
破碎細胞和滅活RNA酶同步進(jìn)行的方法
（一）實(shí)驗程序
如不謹慎操作，外源性RNA酶可以通過(guò)下述途徑污染RNA制品：
（１）玻璃制品、塑料制品和電泳槽 滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無(wú)RNA酶，可以不經(jīng)預處理直接用于制備和貯存RNA。實(shí)驗室用的普通玻璃器皿和塑料制品經(jīng)常有RNA酶法染，使用前必須于180 ℃干烤８小時(shí)或更長(cháng)時(shí)間（玻璃器皿）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯，試管和其他用品。DEPC是RNA酶的強烈抑制劑，但其作用并不是絕對的（Fedorcsak和Ehrenberg,1966）。灌滿(mǎn)DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小時(shí)，然后用滅菌水淋洗數次， 并于100℃干烤15分鐘（Kumar和Lindberg,1972)。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高壓蒸氯滅菌15分鐘。上述處理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通過(guò)羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾。
羧甲基化的RNA在無(wú)細胞體系中翻譯效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤堿基均被修飾，否則其形成DNA：RNA或RNA：RNA雜交休的能力并不明顯降低。用于RNA電泳的電泳槽應用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿(mǎn)3％的H2O2溶液，于室溫放置10分鐘，然后用0.1 ％DEPC處理過(guò)的水徹底沖洗電泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和電泳槽作上特殊標記，存放在指定地點(diǎn)，為RNA實(shí)驗專(zhuān)用。
（２）研究人員造成的污染 RNA酶最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此，在準備分離的和分析RNA的材料和溶液時(shí)，主有涉及RNA的一切操作過(guò)程中，都應戴一次性手套，接觸“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此進(jìn)行RNA實(shí)驗時(shí)應勤換手套。
（３）污染的溶液 用高壓滅菌的水和RNA研究專(zhuān)用的化學(xué)試劑配制溶液，用干烤過(guò)的藥匙稱(chēng)取試劑，將溶液裝入無(wú)RNA酶的玻璃器皿?？赡艿脑?huà)溶液均應用0.1％DEPC于37℃至少處理12小時(shí)，然后于100℃加熱15分鐘或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高壓下蒸氣滅菌15分鐘。注：DEPC可與胺類(lèi)迅速發(fā)生化學(xué)反應，因些不能用來(lái)處理含有Tris 一類(lèi)的緩沖液?？纱鎺灼啃碌奈撮_(kāi)封的Tris晶體以制備無(wú)RNA酶的溶液。
（二）RNA酶的抑制劑
下面介紹３種廣泛應用的特異性RNA酶抑制劑。
（１）RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑是 從人胎盤(pán)分離的一種蛋白質(zhì)可與多種RNA酶緊密結合（KI≈3x1010）形成非共價(jià)結合的等摩爾復合物，使RNA酶失活。此蛋白質(zhì)體內可能是血管生成素的抑制劑，血管生成素是氨基酸序列和推測的三級結構與胰RNA酶類(lèi)似的一種血管生成因子， 幾個(gè)廠(chǎng)家以不同的商品名出售這種抑制劑，該蛋白質(zhì)應置于含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的50％甘油中，貯存于－20℃。抑制劑制品凍融數次后或放置在氧化條件下即應棄之不用，因為上述處理會(huì )使蛋白質(zhì)變性從而釋放出所結合的RNA酶。因此，在使用變性劑裂解哺乳動(dòng)物細胞這一提取RNA的初始步聚中不應使用這種蛋白抑制劑。然而職用更溫和的裂解方法時(shí)應使用這種抑制劑，并且在后續的所有RNA純化步驟中均應有此蛋白質(zhì)存在。由于酚抽提可以除蛋白質(zhì)抑制劑，故應在純化過(guò)程中補加幾次抑制劑。其最大活性的發(fā)揮要求巰基試劑，而且它并不干擾反轉錄或mRNA在無(wú)細胞體系中的翻譯。
（２）氧釩核糖核苷復合物 這種由氧釩（1V）離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復合物，是量種過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物，它能與多種RNA酶結合并幾科能百分之百地抑制RNA酶的活性。這４種氧釩核糖核苷復合物可加入完整細胞中，在RNA提取和純化的所有過(guò)程中，其使用濃度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母細胞中進(jìn)行翻譯， 并能作為某些外酶促反應（如mRNA反轉錄）的模板。然而氧釩核糖核苷復合物強烈抑制mRNA在無(wú)細胞體系中的翻譯，因此必須用含0.1 ％羥基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有幾家公司出售氧釩核糖核苷復合物。
（３）Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就發(fā)現它能吸附RNA酶，用緩沖液將其制成漿液，以0.015％（W/V）的終濃度溶解細胞。 這種粘土隨同它所吸附的RNA酶可在后續的RNA純化過(guò)程中（如酚抽提后）經(jīng)離心去除。
(三）破碎細胞和滅活RNA酶同步進(jìn)行的方法
用強烈變性如鹽酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白質(zhì)， 導致細胞結構破碎，核蛋白由于其二級結構的破壞而從核酸上解離下來(lái)。RNA酶可耐受多種處理等，因此可聯(lián)用上述試劑，從組織中，如富含RNA酶的胰腺中，提取完整無(wú)損的RNA。下述實(shí)驗程序系列利用RNA酶抑制劑和（或）能迅速滅活RNA酶的有關(guān)方法從組織或細胞培養物中分離總RNA、核內RNA和胞質(zhì)內RNA。
（本文轉載丁香通）
