【摘要】 在發(fā)育或分化的不同階段以及疾病模型中，利用miRNA特異的芯片能繪制出細胞和組織的miRNA表達譜，這能夠揭示出參與了這些進(jìn)程的特定miRNA。miRNA的過(guò)表達和沉默，則是一種有力的方法來(lái)研究miRNA的功能。這些研究應當在細胞內或體內進(jìn)行，并與表型和基因表達分析相結合。

     【關(guān)鍵詞】 miRNA    定向克隆    Dicer酶

    lin-4，第一個(gè)已知的miRNA，在1993年被發(fā)現。自此，miRNA的研究就一發(fā)不可收拾。線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅等模式生物的研究鑒定出miRNA的許多重要功能，包括發(fā)育期間細胞增殖和死亡的協(xié)調，抗逆性，脂肪代謝等等。相對于這些低等的模式生物，哺乳動(dòng)物的miRNA功能研究可就復雜得多。

     在開(kāi)始的幾年，科學(xué)家們的首要目標是利用克隆、生物信息學(xué)和基因表達等方法編纂出完整的miRNA目錄和它的表達方式。隨著(zhù)這個(gè)目標日益接近，研究重心又轉移至miRNA功能的闡釋。針對這一目標，涌現出多種技術(shù)，有報告基因分析、原位雜交、過(guò)表達和沉默、生物信息學(xué)預測算法等，它們都有助于miRNA功能的推斷。

     分析miRNA的表達

     在鑒定新的miRNA時(shí)，通常采用三種方法：正向遺傳學(xué)、定向克隆和生物信息學(xué)分析。正向遺傳學(xué)主要運用于果蠅和線(xiàn)蟲(chóng)中，它通過(guò)一個(gè)突變表型來(lái)了解miRNA的功能。第一個(gè)miRNA基因lin-4就是這么鑒定出的。然而，正向遺傳學(xué)這么多年來(lái)也就鑒定出寥寥幾個(gè)miRNA。這是因為miRNA很小，只要突變不影響種子序列，它們就有潛力耐受，因此很難擊中。另外，由于冗余，表型篩選不能識別很多miRNA突變體。因此正向遺傳學(xué)不可能成為鑒定miRNA的主力軍。

     之后，定向克隆技術(shù)的出現，讓多種細胞系和組織中的miRNA大規模鑒定得以實(shí)現，包括人、小鼠和斑馬魚(yú)等。miRNA的克隆流程大致如下：在變性的聚丙烯酰胺凝膠上分離RNA樣品，并回收大小在18-25 nt的片段。接著(zhù)，給RNA加上5’和3’接頭，并進(jìn)行RT-PCR，然后將片段克隆到載體上，構建出cDNA文庫。對單個(gè)克隆進(jìn)行測序和分析，以確定小RNA。目前測序技術(shù)的蓬勃發(fā)展也大大促進(jìn)了這種方法。然而對于某些只在特定細胞類(lèi)型中表達，或以低水平表達的miRNA來(lái)說(shuō)，鑒定起來(lái)還是有難度的。另外，介于物理性質(zhì)或轉錄后修飾，某些miRNA可能難以克隆，這也是一個(gè)棘手的問(wèn)題。

     同時(shí)，科學(xué)家們也開(kāi)發(fā)出多種算法，來(lái)預測miRNA。所有方法都利用了二級結構信息，因為發(fā)夾結構的存在是miRNA的主要特征。其中許多方法還依靠序列的保守性來(lái)區分miRNA候選物和無(wú)關(guān)的基因組發(fā)夾。另一些方法則評估發(fā)夾結構的熱力學(xué)穩定性，與已知miRNA的序列和結構相似度。另一種高效的方法是探索已知miRNA周?chē)幕蚪M序列，因為許多miRNA都是成簇排布。人和小鼠的許多miRNA就是通過(guò)這種方式鑒定出的。當然，計算機預測出來(lái)的候選miRNA還需要實(shí)驗的驗證。

     有時(shí)，我們并不需要全盤(pán)了解所有miRNA，而只是想了解發(fā)育或分化的不同階段、某種疾病狀態(tài)下特異表達的miRNA。這時(shí)，芯片就成為一種強大的工具，能監測組織特異的miRNA表達，幫您挑出關(guān)鍵的miRNA。目前市場(chǎng)上多個(gè)miRNA芯片包括了最新的Sanger miRBase數據庫14.0版的內容，讓您能緊跟形勢。盡管最初miRNA芯片的交叉雜交和特異性為人詬病，但經(jīng)過(guò)改進(jìn)，很多已經(jīng)能夠分辨出單個(gè)堿基的差異。有了它，人們繪制出細胞分化期間的miRNA表達譜；有了它，人們了解到疾病狀態(tài)下異常的miRNA表達模式。ABI公司還開(kāi)發(fā)出一種類(lèi)似芯片的TaqMan miRNA Array，在一張微流體卡片上集合了數百個(gè)TaqMan miRNA Assay，盡管通量不如芯片高，但發(fā)揮了TaqMan分析的優(yōu)勢——高靈敏度、高特異性和寬動(dòng)態(tài)范圍。

     鑒定miRNA的功能

     miRNA的功能研究與基因相似，過(guò)表達和沉默是兩種有力的方法。miRNA的誘導表達常常是許多研究的第一步。將miRNA模擬物（多個(gè)公司有售）轉染到細胞中，就能實(shí)現miRNA的瞬時(shí)過(guò)表達。但長(cháng)期研究就要依賴(lài)質(zhì)粒了。這些重組質(zhì)粒能源源不斷地產(chǎn)生有功能的miRNA，設計起來(lái)也很簡(jiǎn)單。利用常見(jiàn)的蛋白表達載體，將miRNA序列克隆上去，在Dicer酶的切割下，就能產(chǎn)生成熟的miRNA。一些研究小組還將這些質(zhì)粒引入腺病毒或慢病毒系統，以克服原代細胞或干細胞的轉染效率低，或將miRNA導入小鼠體內。不過(guò)，僅有miRNA過(guò)表達的結論往往不讓人信服，我們還需要功能喪失（loss-of-function）實(shí)驗來(lái)證實(shí)。

     對于小鼠中的miRNA研究，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)出一些遺傳方法，來(lái)產(chǎn)生功能喪失的突變。目前主要有三種：(1) Dicer酶的突變，讓所有成熟的miRNA都缺失；(2) 小鼠中miRNA基因的敲除；(3) miRNA 靶位點(diǎn)的突變。不過(guò)，miRNA的高度冗余讓這種功能喪失研究面臨不小的挑戰。而且，許多miRNA是成簇排列的，一個(gè)miRNA的缺失或干擾可能會(huì )影響多順?lè )醋愚D錄本的正確折疊和加工，從而影響相鄰miRNA的表達。近年來(lái)使用較多的是反義靶定的非遺傳學(xué)方法。多個(gè)公司提供miRNA抑制劑。這些2’-O-甲基修飾的寡核苷酸不可逆地抑制了miRNA的功能。

     上述方法提供了miRNA體外和體內功能研究的框架。在發(fā)育或分化的不同階段以及疾病模型中，利用miRNA特異的芯片能繪制出細胞和組織的miRNA表達譜，這能夠揭示出參與了這些進(jìn)程的特定miRNA。miRNA的過(guò)表達和沉默，則是一種有力的方法來(lái)研究miRNA的功能。這些研究應當在細胞內或體內進(jìn)行，并與表型和基因表達分析相結合。

     與轉錄因子類(lèi)似，miRNA也是一大類(lèi)基因調控分子。它們獨特的作用方式需要新的分析策略。系統鑒定miRNA以及研究特定miRNA過(guò)表達或沉默的生物影響的技術(shù)已經(jīng)有了，但是還需要了解影響miRNA功能的信號通路，以及影響miRNA表達的環(huán)境因素或遺傳因素。一旦獲得這些信息，研究人員才有可能設計出新的治療策略，來(lái)治療遺傳和獲得性疾病。

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