流式細胞凋亡檢測問(wèn)答
發(fā)布人：admin
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-20
1. Q：要做胃粘膜組織的DNA含量及倍體檢查，但取材后要等幾個(gè)星期才會(huì )做流式細胞術(shù)檢查，請問(wèn)：胃組織要怎樣保存好呢？用低溫保存，還是用乙醇固定？或者固定后再低溫下保存？
A：我做過(guò)乳腺細胞的DNA含量測定，取得組織以后，先處理成單細胞懸液，然后再加70%冰乙醇固定，要保證冰乙醇的最終濃度為50%，這樣固定的細胞懸液可以至少保存12小時(shí)，最多可保存一個(gè)月，上機檢測前再加PI綜合染液。我就是這樣做的，保存了將近三個(gè)星期，結果還可以，變異系數為5%.
2. 實(shí)驗中想用PI分析細胞周期及凋亡率，請教幾個(gè)問(wèn)題：
Q：（1）所用的RNAs酶用什么配制呢？用PBS配嗎？
A：RNaseA用PBS配制沒(méi)有問(wèn)題，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。
Q：（2）測細胞周期和凋亡率時(shí)都要用RNAs酶，可以一起檢測嗎？
A：用流式細胞儀測定時(shí)細胞周期和凋亡率是同時(shí)測定的，不用擔心。
Q：（3）TritonX-100是固定劑吧，用了70%的冷乙醇（是4℃嗎？），是不是就不用Triton X-100固定了？
A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定劑，可以用75%的乙醇于-20度固定。
Q：（4）還要設什么內參標準（5%雞紅細胞）嗎？
A：對照肯定是需要的，這個(gè)根據自己的需要進(jìn)行設置。
Q：（5）不用試劑盒行不行??？
A：完全可以不用試劑盒。
以下提供一個(gè)自己的實(shí)驗步驟供參考：
（1）200×g離心10 min 收集細胞；
（2）棄去上清，PBS漂洗一次，將細胞重懸于預冷的80%乙醇中，-20°C固定24 h以上；
（3）進(jìn)行流式細胞儀檢測前，200×g離心10 min 收集固定后的細胞；
（4）PBS洗滌一次，200×g離心10 min 收集細胞；
（5）將細胞重懸于含100 ug/ml RNase A和50 ug/ml PI的PBS中，室溫孵育30 min；
（6）將經(jīng)PI染色和RNase A消化后的細胞懸液用300目的尼龍膜過(guò)濾后即可利用流式細胞儀進(jìn)行細胞周期分布和凋亡細胞定量的分析。
3. Q：流式檢測細胞周期時(shí)加RNA酶所需的溫度？
A：
其實(shí)有關(guān)RNA酶在凋亡檢測制樣過(guò)程中使用的必要性問(wèn)題尚有人持不同意見(jiàn)，該觀(guān)點(diǎn)的人認為RNA酶在環(huán)境中無(wú)所不在，常規制樣過(guò)程中所接觸的試劑和環(huán)境中的RNA酶已足以降解樣品中的RNA，所以為了簡(jiǎn)便實(shí)驗操作，也有人不加RNA酶或如你所參考的方法將其與PI染液一起使用。不過(guò)經(jīng)典的方法還是“先加RNA酶37度孵育30 min，然后加PI 4度孵育30 min”。
至于染色時(shí)使用4度，是因為低溫可減弱分子運動(dòng)，增強熒光染料結合的穩定性和減少可能的熒光損耗。上流式前細胞用75%乙醇固定行嗎？
4. Q：我養腫瘤細胞，測周期?？吹教诱f(shuō)70%乙醇必須用PBS和乙醇配，用水配細胞會(huì )碎裂，有帖子說(shuō)PBS和乙醇配會(huì )出現絮狀物。上流式前細胞用75%乙醇固定，就用買(mǎi)來(lái)的現成的瓶裝75%乙醇，行嗎？必須那么嚴格嗎？
A：先用冷PBS懸浮細胞，大約1~2 ml，充分懸浮，使細胞充分分散成單細胞。之后緩慢加入無(wú)水乙醇，終濃度為70~75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇會(huì )導致細胞團聚的現象，很難重懸成單細胞。乙醇固定之后沒(méi)有細胞沉淀。
5. Q：我要做流式分析細胞周期，我大概收集了106細胞，但細胞在乙醇固定之后，還看到有細胞沉淀的，但PBS洗滌兩次之后，就基本沒(méi)什么細胞沉淀了，上機發(fā)現就發(fā)現不了細胞了。這是怎么回事??？怎么解決這個(gè)問(wèn)題??？
A：很可能是洗細胞的過(guò)程中丟失了，解決辦法有：
（1）盡量采用尖底的離心管和水平離心機
（2）離心后盡量用吸管吸取上清，不要傾倒；吸上清時(shí)最好殘留1 mm 左右的水膜，不要吸完。
（3）離心的轉速或時(shí)間可稍微增加一點(diǎn)兒
（4）每次加抗體時(shí)，吸頭最好不要接觸液面；混勻時(shí)最好不要用吸頭吹打，以免吸頭掛壁帶走部分細胞。
6. Q：流式細胞PI單染中為什么用RNAse？
A：在測細胞周期時(shí)，因為已經(jīng)在細胞膜打孔了，PI很容易透過(guò)細胞膜和DNA結合，但RNA也是核酸，也會(huì )被染色，為避免干擾染色前需用RNAse降解RNA。這樣PI只染DNA，能精確以熒光強度反映DNA的含量。
7. 最近做了幾次流式細胞儀檢測細胞周期，發(fā)現有幾個(gè)問(wèn)題：
Q：（1）我所用的是腫瘤細胞， 但是同樣的細胞類(lèi)型，同樣的處理因素，雖然兩次獨立實(shí)驗作出來(lái)的結果總體趨勢都是在某種藥物干預后，S期比例下降，但兩次結果S期比列具體數值相差很大，同樣，G2/M期在干預前后無(wú)變化，但兩次獨立實(shí)驗數值卻相差很大，那么可以說(shuō)，做流式是每次細胞狀態(tài)不一樣，結果也會(huì )相差很大，是不是細胞密度會(huì )對結果產(chǎn)生很大影響，那么如果細胞密度在60~70%時(shí)和細胞已經(jīng)長(cháng)滿(mǎn)（90%以上）也會(huì )導致各期數值的差異？如果是這樣，長(cháng)滿(mǎn)的細胞（不再增殖）是表現的G1或S或G2/M上升還是下降？
A：應該是兩批細胞在實(shí)驗時(shí)本身所出周期不同所致，可以在實(shí)驗前進(jìn)行細胞的同步化處理，減少批間差異。實(shí)驗細胞應處于對數生長(cháng)期，而不能是完全長(cháng)滿(mǎn)，一般在50~80%比較好。自然狀態(tài)下，不增殖的細胞應該處于G0/G1期。
Q：（2）其次就是結果分析，細胞周期特異性藥物如抗代謝藥作用后主要表現的是S期比例下降，細胞被阻滯在G1期，自然G1期比列升高。而有些植物藥如長(cháng)春堿類(lèi)或紫杉醇類(lèi)，主要作用于M期，那么結果是否表現為G2期比例升高，還是S期也相應升高？還有就是細胞經(jīng)抗腫瘤藥物作用后反而出現的S期升高，可能是那些原因，如何分析？
A：周期特異性藥物阻滯哪一期，哪一期就升高，不會(huì )使其它階段細胞增多。
8. Q：我用流式做胃癌細胞周期分析時(shí)不出現S、G2/M峰？什么原因呢？自己分析可能為PI沒(méi)染上色，是不是染色時(shí)間太短呢？
A：你用了多少PI染色多久呢？一般來(lái)說(shuō)30分鐘夠了。我覺(jué)得可能是打孔或者rna沒(méi)有處理掉沒(méi)有成功，染色時(shí)間并不是關(guān)鍵。
9. Q：做流式細胞時(shí)，PI 染色，PI的濃度應該是多少？還有就是400目的篩網(wǎng)是什么？不用可以嗎？
A：100 ug/ml，一般用400目的篩網(wǎng)是用來(lái)將粘在一起的細胞團濾掉的，否則會(huì )出現人為的多倍體干擾，分析的時(shí)候需要的是單個(gè)的細胞，不過(guò)如果經(jīng)驗豐富也可以gate掉的。如果你沒(méi)有條件，建議在染色之前將細胞彈的很散，再進(jìn)行染色
10. Q：流式細胞儀觀(guān)察細胞周期樣品怎樣準備？
A：給你介紹一下我的實(shí)驗方法，我做的是周期檢測，要做平行樣，六孔板做的。
（1）收集先棄液，將你要實(shí)驗（你已經(jīng)處理好的）的細胞PBS洗兩次，加胰酶消化（注意：如果要是加藥物或者其他處理過(guò)的細胞，棄液和PBS洗液均收集）；
（2）加培養基終止消化，打勻在分別收到各自離心管中（注意，收集過(guò)程中及后續過(guò)程中槍頭不要混用，要不平行樣也就沒(méi)意思了）；
（3）離心，1000 rpm，5 min 棄液；
（4）4度PBS（1到2 ml）洗兩次，離心，1000 rpm，5 min 棄液；
（5）加入負20度70%酒精（1到2 ml）打勻，固定，至少半個(gè)小時(shí)以上，（不做的話(huà)，可放入4度冰箱保存2~3周問(wèn)題不大）；
（6）離心，1000 rpm，5 min 棄酒精；
（7）4度PBS（1到2 ml）洗，離心1000 rpm，5 min 棄液；
（8）4度PBS（1到2 ml）洗，打勻后，將細胞懸液用100 目的紗布直接過(guò)濾到流式檢測管中；
（9）離心，1000 rpm，5 min 棄液；
（10）加PI染液染色（濃度為50 ug/ml），PBS 32.4 ml ，PI 2.5 mg，Rnase 0.5 mg，（TritonX-100 0.25 ml，枸櫞酸鈉50 mg，這兩我沒(méi)加也效果不錯）加PBS至50 ml，4度避光保存數月。106細胞中加入1 ml PI染液， 振蕩器振勻，避光染色至少30 min， 上機檢測；
（11）統計分析。
