一、細胞復蘇與培養
將液氮或-80℃保存的腫瘤細胞于37℃ 水浴, 快速溶化, 用8.0ml 培養基混勻已融化的腫瘤細胞懸液, 于1500 轉/分, 離心3 分鐘。棄上清, 再吸取8.0ml 培養基質(zhì)混勻細胞沉淀, 再1500
轉/分, 離心3 分鐘, 棄上清, 細胞沉淀用1.0ml 培養基混勻, 備用。另取一個(gè)75cm2 方瓶, 加入14.0ml 培養基質(zhì), 將上述制備的含腫瘤細胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中, 于37℃，5%CO2 孵
育箱中培養。若此腫瘤細胞懸浮生長(cháng), 大約3－4 天細胞基質(zhì)會(huì )變黃, 5.0ml 細胞懸液可傳代一個(gè)方瓶培養, 可用3－4 個(gè)方瓶培養, 一個(gè)方瓶中呈對數生長(cháng)的腫瘤細胞可達1—1.5×107 個(gè),
根據試驗所需, 可決定傳代的次數。若此腫瘤細胞呈貼壁生長(cháng), 經(jīng)過(guò)3—4 天, 腫瘤細胞生長(cháng)至80%—95% 單層時(shí), 棄上清, 用0.5mM 的EDTA(難消化的腫瘤細胞用0.25%胰酶1.0ml), 處
理腫瘤細胞大約3—5 分鐘, 用倒置顯微鏡觀(guān)察，當90% 的腫瘤細胞變圓時(shí), 即可用彎管吹打并將消化的細胞轉移到15ml 離心管中, 于1500 轉/分下，離心3 分鐘, 棄上清, 加少許培養基
混勻, 可傳代3 個(gè)75cm2 方瓶擴大培養。
二、細胞凍存
將對數生長(cháng)的腫瘤細胞用1 個(gè)75cm2 方瓶按上述方法收集, 于1500 轉/分離心3 分鐘,棄上清, 用保種液(含10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混勻, 分別加入到2—3 只保種管中, 寫(xiě)上腫瘤細
胞名稱(chēng), 時(shí)間, 保種者姓名, 放-80℃保存, 次日將它們轉移到液氮中保存(注: -80℃下可保存細胞半年至一年, 液氮可保存細胞5—10 年, 甚至更長(cháng)的時(shí)間)。以上所有物品均需經(jīng)過(guò)高溫滅
菌( 121℃, 30 分鐘)，培養基質(zhì)則經(jīng)過(guò)過(guò)濾(0.22uM)除菌, 所有操作均必須遵守無(wú)菌操作技術(shù), 避免細菌、真菌、病原體、衣原體等污染。
