一、實(shí)驗目的：

  單克隆抗體制備是細胞免疫學(xué)的一個(gè)重要里程碑，它涵蓋了細胞培養、細胞融合、免疫動(dòng)物和抗體效價(jià)檢測等各個(gè)方面內容。了解單克隆抗體制備的原理、主要步驟和方法。

二、實(shí)驗原理：

  骨髓瘤細胞在體外培養能大量無(wú)限增殖，但不能分泌特異性抗體；而抗原免疫的B淋巴細胞能產(chǎn)生特異性抗體，但在體外不能無(wú)限增殖。將免疫脾細胞與骨髓瘤細胞融合后形成的雜交瘤細胞，繼承了兩個(gè)親代細胞的特性，既具有骨髓瘤細胞能無(wú)限制增殖的特性，又具有免疫B細胞合成和分泌特異性抗體的能力。經(jīng)在HAT培養基[含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中進(jìn)行選擇性培養，未融合的脾細胞因不能在體外長(cháng)期存活而死亡；未融合的骨髓瘤細胞合成DNA的主要途徑被培養基中的氨基蝶呤阻斷，又因缺乏次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉移酶（HGPRT），不能利用培養基中的次黃嘌呤完成DNA的合成過(guò)程而死亡。只有融合的雜交瘤細胞由于從脾細胞獲得了次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉移酶，因此能在HAT培養基中存活和增殖。經(jīng)過(guò)克隆選擇，可篩選出能產(chǎn)生特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞，在體內或體外培養，即可無(wú)限制地大量制備單克隆抗體。

三、試劑與器材：

  細胞培養板、解剖器械、平皿、酶標儀、加樣器、細胞計數板、CO₂培養箱、倒置顯微鏡等。

四、操作方法：

  1、抗原制備；

  2、免疫動(dòng)物；

  3、免疫脾細胞和骨髓瘤細胞的制備；

  4、細胞融合；

  5、雜交瘤細胞的選擇培養；

  6、雜交瘤細胞的篩選；

  7、雜交瘤細胞的克隆化；

  8、單克隆抗體的檢定；

  9、分泌單克隆抗體雜交瘤細胞系的建立；

  10、單克隆抗體的大量制備。

五、關(guān)鍵步驟與注意事項：

  1、整個(gè)制備過(guò)程需嚴格無(wú)菌

  2、細胞傳代培養時(shí)注意適時(shí)更換培養液

  （本文轉載丁香園）