Overview：

      Other names：p35; IL12-A; CLMF1; NFSK; NKSF1; Natural Killer Cell Stimulatory Factor 1; Cytotoxic Lymphocyte Maturation Factor 1; NF Cell Stimulatory Factor Chain 1Function:Cytokine that can act as a growth factor for activated T and NK cells, enhance the lytic activity of NK/lymphokine-activated Killer cells, and stimulate the production of IFN-gamma by resting PBMC.

Sequence：

      MCPLRSLLLI STLVLLHHLP HLSLGRSLPT TTASPGRSCL DYSQNLLRAVSNTLQKARQT LEFYSCTSEE IDHEDITKDK TSTVEACLPL ELATNESCLASRETSFITNG HCLASGKTSF MTTLCLRSIY EDLKMYHVEF QAMNAKLLMDPKRQIFLDQN MLAAIAELMQ ALNFDSETVP QKPSLKELDF YKTKVKLCILLHAFRIRAVT IDRMMSYLSS S

2, Features

      DL-IL12A-Ra

      大鼠白介素 12A （IL12A） 酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒

預期應用

      本試劑盒運用雙抗體夾心 ELISA 法定量測定大鼠血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養上清液和其他生物液體中 IL12A 含量。

標本的采集與保存

1. 血清：

      將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置 2 小時(shí)或 4℃ 過(guò)夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃ 或-80℃ 保存，但應避免反復凍融。

2. 血漿：

      用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的 30 分鐘內于 2-8℃ 1000×g 離心 15 分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃ 或-80℃ 保存，但應避免反復凍融。

3. 組織勻漿：

      1）取適量組織塊，于預冷 PBS（0.01mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液，稱(chēng)重后備用（組織塊較大需先剪碎后再勻漿）；

      2）可同時(shí)選用多種勻漿方法達到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃勻漿器，加入 5-10 mL 預冷 PBS 進(jìn)行充分研磨，該過(guò)程需在冰上進(jìn)行（有條件實(shí)驗室可選用機器勻漿）；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反復凍融 進(jìn)一步處理（超聲破碎過(guò)程中注意冰浴降溫；反復凍融法可重復 2 次）。

      3）將制備好的勻漿液于 5000×g 離心 5 分鐘，留取上清即可檢測。

4. 細胞裂解液：

      1）貼壁細胞需要先用胰酶消化，離心收集細胞（懸浮細胞可直接離心收集）；

      2）將收集到的細胞用冷 PBS 洗 3 次；
      3）物理方法裂解細胞（可先超聲破碎細胞，再反復凍融）：

      i 超聲破碎：取適量 PBS 重懸細胞，用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂。

      ii 反復凍融：將待破碎的細胞在-20℃ 以下冰凍，室溫融解，反復 3 次，使細胞溶脹破碎。

      4）將標本于 2-8℃ 1500×g 離心 10 分鐘，收集上清備用。

      5. 細胞培養上清或其它生物標本：

      請 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于 -20℃ 或 -80℃ 保存，但應避免反復凍融。

注意：

      1. 以上標本均需密封保存，4℃ 保存應小于 1 周，-20℃ 不應超過(guò) 1 個(gè)月，-80℃ 不應超過(guò) 2 個(gè)月。

      2. 標本使用前應緩慢均衡至室溫，不應加熱使之融解。

      3. 標本溶血會(huì )影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進(jìn)行此項檢測。

試劑準備

      1. 使用前將所有的試劑和標本緩慢均衡至室溫 （18-25℃），試劑不能直接在 37℃ 溶解。

      2. 標準品 （凍干品）：每瓶標準品加入標準品稀釋液 1 mL，蓋好后室溫靜置大約 10 分鐘，同時(shí)反復顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為 1000pg/mL。準備 7 個(gè)稀釋標準品的 EP 管，每個(gè) EP 管中加入 500μL 的標準品稀釋液，如圖所示依次倍比稀釋成 1000pg/mL，500pg/mL，250pg/mL，125pg/mL，62.5pg/mL，31.2pg/mL，15.6pg/mL，標準品稀釋液 （0pg/mL） 直接作為空白孔。為保證實(shí)驗結果有效性，每次實(shí)驗請使用新的標準品溶液。

      3. 檢測溶液 A 及檢測溶液 B：Detection A 及 Detection B 在使用前請手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。臨用前分別以檢測稀釋液 A 或 B1:100 稀釋 （如：10μL 檢測溶液 A/990μL 檢測稀釋液 A），充分混勻，稀釋前根據預先計算好的每次實(shí)驗所需的總量配制 （100μL/孔），實(shí)際配制時(shí)應多配制 0.1-0.2 mL。

      4. 濃洗滌液：用 580 mL 蒸餾水或去離子水將 20 mL 濃洗滌液稀釋至 600 mL，進(jìn)行 30 倍稀釋。

      5. 底物溶液：請用滅菌的移液器吸頭吸取所需體積的 TMB 至另一干凈容器中使用，容器中剩余的底物應予丟棄，不要倒回 TMB 瓶中。

注意：

      1、 標準品的稀釋不能直接在板中進(jìn)行。

      2、 標準品請于臨用前 15 分鐘內配制。該標準品只能使用一次。

      3、 標準品、檢測溶液 A 工作液、檢測溶液 B 工作液請使用相應的稀釋液配制，不能混淆?；靹驎r(shí)要輕輕充分混勻，避免起泡。為保證實(shí)驗結果的準確請使用微量吸管，并校準微量加液器。請依據所需的量精確配制，盡量不要微量配制 （如吸取檢測溶液 A 時(shí)，一次不要小于 10μL），以避免造成濃度誤差。

      4、 請勿重復使用已經(jīng)稀釋過(guò)的標準品、檢測溶液 A 工作液和檢測溶液 B 工作液。

      5、 濃洗滌液中如有結晶析出，請先溫育至室溫，輕輕混勻，至到結晶完全溶解再進(jìn)行配制。

      6、 試劑盒中部分試劑為儲存液，客戶(hù)需配置成工作液后使用，在配置過(guò)程中如因純凈水質(zhì)量差或水質(zhì)污染，以及實(shí)驗中所用耗材潔凈度差，可能造成實(shí)驗結果不準確，甚至完全錯誤，請使用雙蒸水。

操作步驟

      1.加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔 7 孔，依次加入 100μL 不同濃度的標準品 （見(jiàn)試劑準備 2）?？瞻卓准?100μL（見(jiàn)試劑準備第二步最后一管），余孔加待測樣品 100μL，酶標板加上覆膜，37℃ 溫育 2 小時(shí)。

      2.棄去液體，甩干，不用洗滌。

      3.每孔加檢測溶液 A 工作液 100μL（臨用前配制），酶標板加上覆膜，37℃ 溫育 1 小時(shí)。

      4.棄去孔內液體，每孔用 300μL 的洗滌液洗滌，浸泡 1-2 分鐘，吸去 （不可觸及板壁） 或甩掉酶標板內的液體，在實(shí)驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次 （也可輕拍將孔內液體拍干），重復洗板 3 次。最后一次洗滌后，要把孔內的洗滌液完全甩干。自動(dòng)洗板機亦可。

      5.每孔加檢測溶液 B 工作液 （臨用前配制）100μL，加上覆膜，37℃ 溫育 1 小時(shí)。

      6.棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 4。

      7.每孔加底物溶液 90μL，酶標板加上覆膜，37℃ 避光顯色 （反應時(shí)間控制在 15-25 分鐘，不要超過(guò) 30 分鐘。當標準孔的前 3-4 孔有明顯的梯度藍色，后 3-4 孔梯度不明顯時(shí)，即可終止）。

      8.每孔加終止溶液 50μL，終止反應，此時(shí)藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現顏色不勻一，請輕輕晃動(dòng)酶標板以使溶液混合均勻。

      9.在確保酶標板底無(wú)水滴及孔內無(wú)氣泡后，立即用酶標儀在 450nm 波長(cháng)測量各孔的光密度 （O.D. 值）。


注意：

      1.試劑準備：準備一次實(shí)驗所需要的酶標條，其它的可從微孔板上拆下，密封，按照說(shuō)明書(shū)要求保存，以備下次使用。

      2.加樣：實(shí)驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。加樣時(shí)注意不要有氣泡，將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。加樣或加試劑時(shí)，第一個(gè)孔與最后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì )導致不同的「預溫育」時(shí)間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。因此，一次加樣時(shí)間 （包括標準品及所有樣品） 最好控制在 10 分鐘內。推薦設置復孔進(jìn)行實(shí)驗。

      3.溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實(shí)驗時(shí)請將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內，以避免液體蒸發(fā)，洗板后應盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應避免酶標板處于干燥狀態(tài)，同時(shí)應嚴格遵守給定的溫育時(shí)間和溫度。

      4.洗滌：充分的洗滌非常重要，在每次洗滌過(guò)程中，都要將洗滌液完全甩干。洗滌過(guò)程中反應孔中殘留的洗滌液應在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響最后的酶標儀讀數。如果有自動(dòng)洗板機，應在熟練使用后再用到正式實(shí) 驗過(guò)程中。

      5.反應時(shí)間的控制：加入底物后請定時(shí)觀(guān)察反應孔的顏色變化 （比如，每隔 10 分鐘觀(guān)察一次），如顏色較深，請提前加入終止液終止反應，避免反應過(guò)強從而影響酶標儀光密度讀數。

      6.底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時(shí)避免強光直接照射。

      7.如果實(shí)驗室內濕度低于 60%，推薦使用加濕器提高濕度水平。

實(shí)驗原理

      將 IL12A 抗體包被于 96 孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入標準品或標本，其中的 IL12A 與連接于固相載體上的抗體結合，然后加入生物素化的 IL12A 抗體，將未結合的生物素化抗體洗凈后，加入 HRP 標記的親和素，再次徹底洗滌后加入 TMB 底物顯色。TMB 在過(guò)氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 IL12A 呈正相關(guān)。用酶標儀在 450nm 波長(cháng)下測定吸光度 （O.D. 值），計算樣品濃度。

典型數據

      為了便于計算，盡管濃度為自變量而 O.D. 值為因變量，我們繪圖時(shí)仍采用標準品的 O.D. 值作為橫坐標 （X 軸），標準品的濃度為縱坐標 （Y 軸）。同時(shí)為了試驗結果的直觀(guān)性，圖中提供的是原始數據而非對數值。推薦使用對數 值建立標準曲線(xiàn)圖。由于實(shí)驗操作條件的不同（如操作者、移液技術(shù)、洗板技術(shù)和溫度條件等），標準曲線(xiàn)的 O.D. 值會(huì )有所差異。所提供的標準曲線(xiàn)僅供參考，實(shí)驗者需要根據自已的實(shí)驗建立標準曲線(xiàn)。

檢測范圍

      15.625pg/mL-1000pg/mL

最低檢測限

      6.1pg/mL

      此值為 20 個(gè)空白樣品 （即標準品稀釋液） 測定的平均值加二倍標準差所對應的濃度。

特異性

      本試劑盒用于檢測 IL12A，經(jīng)檢測與其它相似物質(zhì)無(wú)明顯交叉反應。

      由于受到技術(shù)及樣本來(lái)源的限制，不可能完成對所有相關(guān)或相似物質(zhì)交叉反應檢測，因此本試劑盒有可能與未經(jīng)檢測的其它物質(zhì)有交叉反應。

穩定性

      經(jīng)測定，試劑盒在有效期內按推薦溫度保存，其活性降低率小于 5%。

      為減小外部因素對試劑盒破壞前后檢測值的影響，實(shí)驗室的環(huán)境條件需盡量保持一致，尤其是實(shí)驗室內溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗員來(lái)進(jìn)行操作可減少人為誤差。

   （本文轉載丁香園）