1.
前言
了解活體的骨代謝狀態(tài)是研究相關(guān)細胞生理活性的一個(gè)有效方法。對骨組織進(jìn)行堿性磷酸酶（ALP）染色后可以了解成骨細胞的骨形成情況，對骨組織進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色可以了解破骨細胞的骨吸收情況。若在同一切片上進(jìn)行雙重染色就能同時(shí)了解兩者的情況。另外，它有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在脫鈣標本里，只要可以雙重染色，無(wú)需專(zhuān)用的設備，僅用一般的設備就可以方便地觀(guān)察到骨代謝。在此前提下，我們需要研究探討雙重染色的可行性。
實(shí)驗材料及方法：
2.
標準標本的制作
用樹(shù)脂包埋法或凍結切片法制成的標本作為標準標本，與脫鈣的石蠟切片作比較。也就是說(shuō)，酒精固定小鼠肘關(guān)節后，用乙二醇甲基丙烯酸甲酯（GMA）包埋，使用硬組織用的切片機制作成2μｍ的切片，然后進(jìn)行TRAP與ALP染色（圖1）。繼而，制成脫鈣凍結切片（圖2）。之后，研究并改良在固定、脫鈣、染色各階段中雙重染色的可行性。
圖1.
標準標本（GMA樹(shù)脂包埋）
照片是小鼠的肘關(guān)節的染色標本，作為本實(shí)驗的標準標本。左上圖是TRAP染色，右上圖是ALP染色。下圖是兩者的雙重染色。以此作為陽(yáng)性對照，與脫鈣石蠟切片一起進(jìn)行染色及染色性的評價(jià)。
圖2.
脫鈣凍結切片的酶染色
用30%的庶糖液浸泡經(jīng)檸檬酸脫鈣的小鼠腰椎及右上肢，然后經(jīng)OCT復合物的包埋、Tissue-Tek PINO（Sakura
Finetek Japan Co.,Ltd.產(chǎn)品）的凍結、Cryo 3（Sakura Finetek Japan
Co.,Ltd.產(chǎn)品）的切割，得到5μｍ的凍結切片。切片進(jìn)行酶染色。不僅可以進(jìn)行TRAP染色（左圖：紅色）與ALP染色（中間：褐色）的單染色，還可以進(jìn)行雙重染色（右圖）。
圖3. 經(jīng)福爾馬林進(jìn)行第一次固定的固定時(shí)間及TRAP/ALP的
染色性研究
①是沒(méi)有經(jīng)過(guò)福爾馬林固定，只用酒精進(jìn)行第二次固定的樣品，ALP染色顯強陽(yáng)性。TRAP染色顯陰性。②是經(jīng)福爾馬林16小時(shí)固定及③是4天固定后，TRAP與ALP都能很好地染色。然而，經(jīng)福爾馬林固定一個(gè)月后的臨床樣本（骨軟骨腫）雖然TRAP染色顯陽(yáng)性，但ALP不能被染色。
圖4.
不同種類(lèi)的脫鈣溶液對雙重染色的影響
最左圖是選用酸性脫鈣溶液中對組織傷害較少的甲酸福爾馬林
脫鈣溶液脫鈣3天（Histra-DC,8～16℃）后的大鼠膝關(guān)節。TRAP與ALP都不能被染色。與此相反，中間的檸檬酸鹽酸鹽脫鈣溶液及最右的EDTA脫鈣溶液都可以使樣品脫鈣后進(jìn)行TRAP/ALP雙重染色。
3.
關(guān)于固定
ALP染色使用不是由福爾馬林固定的新鮮材料，因此若不在短時(shí)間內固定，就會(huì )失去其酶活性。我們建議使用80%的酒精去固定。請驗證以下情況：
①
小鼠的膝關(guān)節不進(jìn)行第一次固定，直接用酒精浸泡進(jìn)行第二次固定組。
②
經(jīng)福爾馬林（4％多聚甲醛溶液）第一次固定小鼠腰椎16小時(shí)后，再用酒精進(jìn)行第二次固定組。
③
經(jīng)福爾馬林進(jìn)行第一次固定小鼠腰椎4天后，再進(jìn)行第二次固定組。
④
臨床的樣本經(jīng)福爾馬林進(jìn)行第一次固定小鼠腰椎一個(gè)月后，再進(jìn)行第二次固定組。
各組進(jìn)行TRAP、ALP的雙重染色,并檢驗染色是否可行。圖3是染色的研究結果。在本實(shí)驗中，福爾馬林固定時(shí)間為16小時(shí)至4天的可以進(jìn)行TRAP、ALP的雙重染色。
4.
關(guān)于脫鈣
ALP是含有金屬（Zn）的蛋白。脫鈣作用會(huì )使Zn也一并被除去而導致酶失去活性。為了彌補這個(gè)缺點(diǎn)，加入硫酸鋅（ZnSO4），使ALP活化。每100ml的脫鈣溶液加入0.4ml
1%的ZnSO4
溶液，以補充Zn。并且，在作為脫鈣溶液檸檬酸鹽酸鹽緩沖液中添加Zn的同時(shí)，加入相同量螯合劑EDTA溶液的相關(guān)研究在進(jìn)行中。也有研究在酸性脫鈣溶液（甲酸福爾馬林溶液）中的酶是否能反應。結果顯示脫鈣溶液與檸檬酸一樣，在EDTA溶液中能很好地染色。相反，在甲酸福爾馬林溶液中不能使酶染色（圖4）。此外脫鈣方法是用超聲波脫鈣裝置（Histra-DC，普通光度）在8-16℃的低溫下，連續操作3-6天，使樣品脫鈣。脫鈣后用甘氨酸與佛羅那
（Veronal）緩沖液(pH7.4)洗凈，用磷酸鈣在組織上吸附，防止沉淀。
5.
關(guān)于染色
染色法使用的是Lorch的Gomori法。本實(shí)驗使用的是同時(shí)采用偶氮染色法和偶聯(lián)反應法的TRAP/ALP染色試劑盒（和光純藥，產(chǎn)品編號294-67001）。關(guān)于切片的厚度，Lorch建議為8μm，同時(shí)也研究過(guò)普通的4μm切片是否能染色、雙重染色的順序應該先染TRAP和ALP中的哪一個(gè)、封片劑是否必須選水溶性封片劑等問(wèn)題。
染色法的結果是偶氮染色法中，切片過(guò)厚就會(huì )有酶擴散現象，即骨基質(zhì)的TRAP染色傾向染成紅色。即使是4μm的切片，只要增強了反應條件（反應溫度及反應時(shí)間），也能充分染色。也就是說(shuō)，TRAP染色反應溫度為室溫至37℃，反應時(shí)間為30分鐘至45或60分鐘。ALP染色可在37℃下反應45分鐘至3小時(shí)，也可在室溫（10~15℃）下延長(cháng)反應時(shí)間至一晚。最后，可以得到兩者色調平衡、良好的染色結果（圖5）。但是，增強反應條件會(huì )使ALP染色的切片上產(chǎn)生更多的色素顆粒（圖2）。而TRAP與ALP的染色順序從任意一方開(kāi)始都可以。但是，先ALP再TRAP染色時(shí)，陽(yáng)性部位呈現明顯紅色，使用新鮮的破骨細胞染色，能得到相對好的標本。但是ALP的反應原產(chǎn)物因TRAP溶液而產(chǎn)生白色混濁顆粒狀體，會(huì )在組織上沉淀。因此，先TRAP染色再ALP染色的話(huà)會(huì )比較好。封片：用甲基綠，幾秒即可使核染色，水洗后在37℃下干燥，經(jīng)二甲苯透明，經(jīng)屈大麻酚(Marinol)永久封片。有文獻建議在透明前使用酒精脫水，但這會(huì )使反應產(chǎn)物浸出及擴散。
圖5.
脫鈣石蠟包埋切片的TRAP/ALP雙重染色
使用1歲小鼠腰椎的EDTA脫鈣石蠟切片進(jìn)行TRAP/ALP雙重染色。破骨細胞的TRAP染色呈紅色，細胞活性強的細胞（成骨細胞、軟骨細胞）ALP染色為褐色。（上面：弱擴大，下面：強擴大）
6.
結語(yǔ)
TRAP與ALP兩種酶在每次固定、脫鈣、染色后，只要經(jīng)過(guò)若干改良，就可以使脫鈣后的石蠟標本染色。但是，酶擴散現象，特別是在TRAP染色時(shí)這種現象更明顯。影響因素有多種，主要應該是受固定的影響，若固定不充分，脫鈣時(shí)很容易出現問(wèn)題，從而導致酶擴散現象的發(fā)生。此外必須注意脫鈣自身的影響，也就是說(shuō)，與非脫鈣標本相比，脫鈣標本觀(guān)察到的擴散現象較多。說(shuō)明標本脫鈣很可能導致酶擴散。另外，也應考慮切片的厚度或雙重染色的順序影響。今后我們將向這個(gè)方向研究。
（本文轉載丁香園）
