實(shí)驗方法原理
很多球狀蛋白均能在水溶液或鹽溶液的表面形成不溶的變性薄膜，在適當的條件下這一薄膜可以成為單分子層，由伸展的肽鏈構成為一個(gè)分子網(wǎng)。當核酸分子與該蛋白質(zhì)單分子膜作用時(shí)會(huì )由于蛋白質(zhì)的氨基酸堿性側鏈基團的作用，使得核酸從三維空間結構的溶液構型吸附于肽鏈網(wǎng)而轉化為二維空間的構型，并從形態(tài)到結構均能保持一定程度的完整性。最后將吸附有核酸分子的蛋白質(zhì)單分子膜轉移到載膜上，用負染等方法增加樣品的反差后置電鏡觀(guān)察。
實(shí)驗材料 質(zhì)粒 pBR322
試劑、試劑盒 堿性球狀蛋白溶液醋酸鐵乙二胺四乙酸二鈉蒸餾水滑石粉無(wú)水乙醇醋酸鈾乙醇溶液
儀器、耗材 微量注射器移液槍載玻片平皿有支持膜的載網(wǎng)鑷子濾紙
實(shí)驗步驟
1. 將質(zhì)粒 pBR322 與一堿性球狀蛋白溶液（一般為細胞色素 c）混合。使濃度分別達到 0.5～2 mg/ml 和 0.1 mg/ml，并加入終濃度為 0.5～1 mol/L 的醋酸鐵和 1 mmol/L 的乙二胺四乙酸二鈉，成為展開(kāi)溶液， pH 為 7.5。
2. 在一干凈的平皿中注入一定下相溶液（蒸餾水或 0.1～0.5mol/L 的醋酸鐵溶液），并在液面上加入少量滑石粉。將一干凈載玻片斜放于平皿中，用微量注射器或移液槍吸取 50 μl 的展開(kāi)溶液，在離下相溶液表面約 1 cm 左右的載玻片上前后擺動(dòng)，滴于載玻片的表面，此時(shí)可看到滑石粉層后退，說(shuō)明蛋白質(zhì)單分子膜逐漸形成，整個(gè)過(guò)程約需 2～3 min。
3. 單分子膜形成后，用電鏡銀子取一覆有支持膜的載網(wǎng)，使支持膜朝下，放置于離單分子膜前沿 1 cm 或距離載玻片 0.5 cm 的膜表面上，并用鑷子即刻撈起。單分子膜即吸附于支持膜上，多余的液體可用小片濾紙吸去，也可將載網(wǎng)直接漂浮于無(wú)水乙醇中 10～30 s。
4. 將載有單分子膜的載網(wǎng)置于 10-3～10-5mol/L 的醋酸鈾乙醇溶液中染色約 30 s（此步可在用乙醇脫水時(shí)同時(shí)進(jìn)行），或用旋轉投影的方法將金屬?lài)婂冇诤怂針悠返谋砻?。也可將二種方法結合起來(lái)，在染色后再進(jìn)行投影，其效果有時(shí)比單獨使用一種方法更好一些。
注意事項
1. 在單分子膜形成時(shí)，整個(gè)裝置最好用玻璃罩等物蓋住，以防操作人員的呼吸和旁人走動(dòng)等引起氣流的影響以及灰塵等臟物的污染。
2. 在展開(kāi)溶液中可適量加入一些與核酸量相差不過(guò)懸殊的指示標本，如煙草花葉病病毒等，以利于鑒定單分子膜的展開(kāi)及后面轉移的好壞。
3. 在蛋白形成單分子膜時(shí)，溶液中的核酸分子也同時(shí)分布于蛋白質(zhì)基膜中間，并略受蛋白質(zhì)肽鏈的包裹。理論計算及實(shí)驗證明，當 1 mg 的蛋白質(zhì)展開(kāi)成良好的單分子膜時(shí)，其面積約為 1 m2。因而可根據最后形成的單分子膜面積的大小估計其好壞程度。如果面積過(guò)小。說(shuō)明形成的膜并非單分子層，因而核酸就有局部或全部被膜包裹的危險，使整個(gè)核酸分子消失或反差變壞。
4. 載玻片傾斜的角度決定了展開(kāi)液下滑至下相溶液的速度，并對單分子膜的形成質(zhì)量有影響，經(jīng)驗證明傾斜度以 15° 左右為宜。（轉帖）
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