從包涵體中純化表達蛋白
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發(fā)布時(shí)間：2016-10-31
實(shí)驗材料：
表達靶蛋白的大腸桿菌細胞試劑、試劑盒：細胞裂解緩沖液I、細胞裂解緩沖液Ⅱ、脫氧膽酸、濃鹽酸、包涵體溶解緩沖液I、包涵體溶解緩沖液Ⅱ、KOH、PMSF、SDS 凝膠加樣緩沖液、含尿素的Tris-Cl、DNaseI、溶菌酶、SDS-聚丙烯酰胺凝膠儀器、耗材：Sorvall GSA 轉頭或相當的轉頭、pH試紙、磨光玻璃棒
實(shí)驗步驟材料：
1、緩沖液和溶液
2、貯存液、緩沖液和試劑的成分請參見(jiàn)附錄 1。貯存液稀釋至適當濃度。
3、細胞裂解緩沖液 I 50 mmol/LTris-Cl(pH8.0) 1mmol/LEDTA(pH8.0) 100 mmol/LNaCl
4、細胞裂解緩沖液Ⅱ, 冰冷 50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 10 mmol/L EDTA(pH8.0) 100 mmol/LNaCl 0.5% TritonX-100
5、脫氧膽酸使用蛋白級的膽酸/去污劑。
6、HCl(12mol/L)(濃鹽酸）
7、包涵體溶解緩沖液 I 50 mmol/LTris-Cl(pH8.0) 1 mmol/LEDTA(pH8.0) 100 mmol/LNaCl 8mol/L 尿素 0.1mol/LPMSF 緩沖液現用現配。
8、包涵體溶解緩沖液Ⅱ 50 mmol/LKH2PO4(pH10.7) 1 mmol/LEDTA(pH8.0) 50 mmol/LNaCl
9、KOH(10mol/L)
10、PMSF(100 mmol/L)
11、1x 和 2XSDS 凝膠加樣緩沖液 不含 DTT 的 1x 和 2xSDS 凝膠加樣緩沖液室溫保存， lmol/LDTT 貯存液現用現加于上述緩沖液。
12、含尿素的 Tris-Cl(0.1mol/L,pH8.5) 僅限于方法 2 使用，請見(jiàn)步驟 7。配制內含尿素濃度遞增（如 0.5、1、2 和5mol/L) 的0.1mol/L Tris-Cl(PH8.5)。使用前用固體尿素現用現配，不能使用任何尿素貯存液，因為尿素容易分解。
13、酶和緩沖液
14、DNaseI(1 mg/ml)
15、溶菌酶（10 mg/ml)
16、用 Tris-Cl(PH8.0) 現用現配。
17、凝膠
18、SDS-聚丙烯酰胺凝膠（10%) 用于分離蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠的制備請參考附錄 8
19、離心機和轉頭 20Sorvall GSA 轉頭或相當的轉頭 特別配備
20、pH 試紙 備用，請見(jiàn)步驟 10。
21、磨光玻璃棒
22、載體和細菌菌株
23、表達靶蛋白的大腸桿菌細胞 培養 1L 以包涵體形式表達靶蛋白的大腸桿菌細胞方法制備細胞抽提物 1.1L 表達細胞培養物于預先稱(chēng)重的離心管中 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 轉頭）離心 15 min。
注意：
1.步驟 2~4—定要在 4°C 進(jìn)行。
2. 吸去上清，稱(chēng)菌體沉淀的重量，每克（濕重）菌體加入 3 ml 細胞裂解緩沖液 I，輕輕旋動(dòng)或用磨光玻璃棒攪動(dòng)，使菌體懸起。
3. 每克（濕重）菌體加入 4ul 100 mmol/LPMSF,80ul 10 mg/ml 溶菌酶，攪動(dòng) 20 min 也可以加入其他蛋白酶抑制劑混和物（見(jiàn)方案 1)。
4. 每克（濕重）菌體加入 4 mg 脫氧膽酸，繼續攪動(dòng)。
5. 懸液 37°C 放置，不時(shí)用磨光玻璃棒攪動(dòng)，待其變黏時(shí)每克（濕重）菌體加入 20ul 1 mg/ml DNaseI。
6. 裂解液室溫放置，直至不再黏稠（約 30 min)。純化和洗滌包涵體
7. 用下述兩種方法之一純化和洗滌包涵體。方法 1: 用 Triton X-100 提取包涵體下述流程是對 Marston 等（1984) 所用方法的改進(jìn)。
a. 細胞裂解物 4°C 高速離心 15 min。
b. 傾倒去除上清，沉淀重懸于 9 倍體積的 4°C 細胞裂解緩沖液Ⅱ。
c. 懸液室溫放置 5 min。
d. 高速離心 15 min。
e. 傾倒上清，留置待用。沉淀重懸于 100ul 水。
f. 各取 10ul 上清和沉淀，分別與 10ul 2XSDS 凝膠加樣緩沖液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析靶蛋白的分布。
g. 必要時(shí)繼續步驟 8 溶解包涵體。
方法 2: 用尿素提取包涵體下面的程序是用含有不同濃度尿素的緩沖液洗滌和溶解包涵體，摘自 Schoner 等 (1985)。
a. 細胞裂解物 4°C 高速離心 15 min。注意：步驟 b、d 和 f 必須在 4°C 進(jìn)行。
b. 傾倒去除上清，每克（濕重）菌體沉淀重懸于 1 ml 水中。每支 100ul 裝 4 支離心管，其余 4°C保存。 c.4°C 高速離心 15 min。
d. 毎份沉淀重懸于 100ul 含不同濃度（如 0.5、1、2 和 5mol/L) 尿素的 0.1mol/L Tris-Cl(pH8.5)。e.4°C 高速離心 15 min。
f. 傾倒上清，留置待用，每份菌體沉淀重懸于 100ul 水中。
g，各取 10ul 上清和沉淀，分別與 10ul 2XSDS 凝膠加樣緩沖液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析哪個(gè)濃度的尿素洗滌效果最佳。
h. 用步驟 g 確定的最佳濃度，按上述方案洗滌剩余包涵體沉淀（步驟 b)。
i. 必要時(shí)繼續步驟
8 溶解包涵體。溶解包涵體8. 取適量步驟 7 的重懸細胞沉淀，4°C 高速離心 15 min, 沉淀重懸于 100ul 含 0.1 mmol/LPMSF(現用現加）的包涵體溶解緩沖液 I。
9. 室溫放置 lh。
10. 把溶液加入到 9 倍體積的包涵體溶解緩沖液 II 中，室溫放置 30 min。檢査 pH 是否維持在 10.7,必要時(shí)用 10mol/LKOH 調節。
11. 用 12mol/L 鹽酸將溶液 pH 調至 8.0, 室溫放置至少 30 min。
12. 室溫高速離心 15 min。
13. 傾倒上清，留置待用，沉淀重懸于 100ul 1XSDS 凝膠加樣緩沖液
14. 取 10ul 上清與 10ul 2xSDS 凝膠加樣緩沖液混和，上清和沉淀分別進(jìn)行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳，分析溶解程度，繼續附加方案。
