很多做實(shí)驗的小伙伴，在培養細胞的過(guò)程中都是困難重重，最最常見(jiàn)的可能就是微生物感染細胞了，這一步驟輕則細胞重新培養，重則連帶污染培養箱內的其他細胞，甚至整個(gè)實(shí)驗室的環(huán)境，給科研工作帶來(lái)嚴重的損失和威脅。

這一步若是沒(méi)有跨過(guò)去，后面的實(shí)驗根本無(wú)法進(jìn)行啊，所以話(huà)不多說(shuō)，我們馬上開(kāi)始今天的實(shí)驗小課堂。

首先，我們要知道體外細胞污染可分為3 類(lèi): 物理性、化學(xué)性、生物性污染。其中生物性污染常見(jiàn)且造成的后果也較為嚴重，常見(jiàn)的生物污染類(lèi)型有細菌污染、真菌污染、支原體污染、黑膠蟲(chóng)污染、原蟲(chóng)污染等。

（真菌污染圖，圖為本公司實(shí)驗圖，勿盜）

細菌污染：

細菌污染特點(diǎn)為污染速度快，易被發(fā)現。細菌污染后，PH 值改變。細菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，根據感染細菌的不同，可有不同的外形，培養液一般1~2天會(huì )渾濁變黃，對細胞生長(cháng)影響明顯。

解決方法：

對于不是很珍貴的細胞，可丟棄。

若是很珍貴的細胞，建議分別配置含10倍雙抗的PBS和5倍雙抗的完全培養基各一份.先用10倍雙抗的PBS洗滌細胞5-10次.然后用5倍雙抗的完全培養洗滌細胞3次以上,并在其后每培養1小時(shí)換液一次,最后2倍雙抗培養基培養過(guò)夜,第二天換成一倍雙抗完全培養基繼續培養,傳代一次以上,如未發(fā)現污染,即可凍存,并留出部分細胞繼續采用無(wú)雙抗培養基培養48小時(shí)以上,最終確定細胞不含有任何污染物。

霉菌污染： 

培養液清亮，倒置顯微鏡下無(wú)雜質(zhì)，37度孵箱培養2-3天，仍清亮，細胞仍可生長(cháng)。但出現絮狀雜質(zhì)，污染后的鏡下特點(diǎn)為: 低倍鏡下可見(jiàn)乳白色的團狀漂浮物，培養液無(wú)變化; 高倍鏡下可見(jiàn)明顯的菌絲，細胞活力變差，生長(cháng)速度明顯變慢，甚至死亡。污染的主要來(lái)源為實(shí)驗人員( 實(shí)驗服)。

解決方法:

霉菌污染初期，將污染的細胞培養液慢慢吸出，用Hanks 液清洗細胞及瓶壁2-3次，加入含有以下抗生素的培養液，即青霉素100單位/ml，鏈霉素100 單位/mL，兩性霉素 10mg/L，24h 后觀(guān)察換液，若仍有菌絲可重復上述步驟進(jìn)行處理，2-3次后就基本得到控制。但此種方式處理后對細胞的生長(cháng)影響也較大。

但細胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線(xiàn)菌素D或雙抗都于事無(wú)補，建議舍棄該污染細胞。，將環(huán)境徹底消毒

支原體污染：

常見(jiàn)的污染現象，特點(diǎn)為短期無(wú)變化，具有隱蔽性。它們可以與細胞長(cháng)期共存，培養基一般不發(fā)生渾濁，細胞無(wú)明顯變化。污染后鏡下特點(diǎn): 在光鏡下?？梢?jiàn)到細胞核及胞漿內出現大小不等的顆?；蚩张?。污染的主要來(lái)源為血清。而支原體是牛血清中最常見(jiàn)的微生物之一。

解決方法：支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體。要注意的是：支原體沒(méi)有細胞壁，故作用于細胞壁生物合成的抗生素，如內酰胺類(lèi)、萬(wàn)古霉素等是不敏感的； 所以主要的清除方法有抗血清處理法、高溫處理法、巨噬細胞清除法、選擇性殺滅哺乳動(dòng)物類(lèi)細胞培養物中支原體的方法，其中巨噬細胞清除法效果較好。

巨噬細胞吞噬法：從動(dòng)物腹腔采取巨噬細胞，為排除其它細胞成分，可先進(jìn)行純化，然后再加入被支原體污染的細胞培養液中混合培養。在培養過(guò)程中，為檢查支原體是否已被消除干凈，可利用支持物培養法驗證，取出支持物逐日染色、鏡檢觀(guān)察，至支原體已被消除干凈為止。

黑膠蟲(chóng)污染：

可以穿透濾膜，也可以通過(guò)空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍下可看見(jiàn)黑色的小蟲(chóng)游來(lái)游去。常常是細胞生長(cháng)狀態(tài)良好，且觀(guān)測到的運動(dòng)物無(wú)明顯增多，且培養液顏色、透明度無(wú)明顯變化。其污染特點(diǎn)為開(kāi)始對細胞無(wú)影響，當數量達到一定程度時(shí)就會(huì )對細胞產(chǎn)生影響。污染主要來(lái)源于血清。

解決方案：

對細胞生長(cháng)狀態(tài)不會(huì )有明顯影響，在細胞增殖旺盛之后會(huì )自然消失，除更換血清外無(wú)須特殊處理。建議如果細胞有可能是此種污染的話(huà)，可以增加細胞的種板密度，以提高細胞的生存率。

細胞交叉污染：

由于細胞培養操作時(shí)各細胞株所需的器材和溶液沒(méi)有嚴格分開(kāi)，往往會(huì )使一種細胞被另一種細胞污染。鏡下可發(fā)現細胞的形態(tài)發(fā)生改變，與正常該細胞株的形態(tài)不同。

解決方案：

若發(fā)生細胞的交叉污染，通常不能挽回，只能放棄細胞。為避免細胞的交叉污染，在進(jìn)行多種細胞培養操作時(shí)，所用器具要嚴格區分，最好做上標記便于辨別，并按順序進(jìn)行操作，避免一起進(jìn)行時(shí)發(fā)生混亂，以免把細胞帶到培養液中污染其他細胞。