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原代培養操作

原代培養操作

  (1)取懷孕14~20d的母鼠,斷頸處死,固定在解剖臺上,用2%碘酒和75%酒精棉球消毒腹部皮膚。無(wú)菌條件下,用大手術(shù)剪將皮毛層從胸骨柄下部剪到恥骨聯(lián)合。換用小直剪剪開(kāi)腹肌,剖開(kāi)腹腔,暴露子宮。

  (2)用鑷子將子宮提起,眼科剪依次剪斷子宮系膜,分離出子宮。剪斷子宮角,取出整個(gè)子宮,在無(wú)菌濾紙上吸干血跡。置于盛有Hanks的培養皿內。用Hanks洗滌子宮表面,棄除表面殘余血跡。

  (3)縱向剪開(kāi)子宮,取出帶有胎膜的胚胎,置于另一盛有Hanks的培養皿內,充分洗滌,棄除表面的血跡。剪開(kāi)胎膜,取出胎鼠,棄除胎膜。用Hanks洗滌3次。

  (4)剪去胚胎頭部、四肢、除去內臟。將軀干部置于另一盛有Hanks液的培養皿內。用Hanks洗滌3次,匆留任何血跡。

  (5)用彎頭剪把胚胎軀干盡量剪碎,每個(gè)組織塊小于1mm3大小。在操作時(shí)應盡量將平皿蓋半蓋住平皿以防空氣中塵埃落下污染組織。再用Hanks液洗滌2或3次,清洗后使組織塊自然沉淀。用吸管吸去上清液。以下可按兩種方法進(jìn)行。即消化法和組織塊培養法。

  (6)若使用消化法,則將組織塊放入一無(wú)菌三角瓶?jì)?。三角瓶?jì)阮A置一個(gè)磁力攪棒。加入10~30mL的0.125%的胰蛋白酶。37℃磁棒攪拌消化20min以上。加入少量血清終止消化過(guò)程。用幾層無(wú)菌紗布過(guò)濾。取過(guò)濾液,800r/min離心5~10min收集細胞。棄上清,加入帶有雙抗的培養基,放入培養瓶培養。

  (7)若進(jìn)行組織塊培養,則不做步驟(6),加入幾滴血清于組織塊中,再用彎頭吸管將組織塊懸液吸起。在一小方瓶中逐個(gè)鋪展開(kāi),注意將瓶底涂抹均勻。將瓶子翻轉倒置后在37℃培養箱內放置2~3h。待組織塊微干與瓶壁粘牢后再輕輕將瓶子翻轉過(guò)來(lái),從邊角加入4~5mL培養基,使細胞接觸到培養液。放培養箱內繼續進(jìn)行培養。

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