實(shí)驗方法原理

實(shí)驗材料：凍存 HeLa S3 細胞

試劑、試劑盒：70% 乙醇完全 MEM-10胰酶／EDTA

儀器、耗材：旋轉瓶完全培養基-525 cm2 組織培養瓶C02 培養箱Sorvall H-6000A 轉子100 ml 或 200 ml 通氣旋轉瓶和帶濾膜的瓶蓋

實(shí)驗步驟

1. 將含有凍存 HeLa S3 細胞的安瓿放入 37℃ 水浴中解凍。

2. 用 70% 乙醇對安瓿的頂端進(jìn)行消毒，打開(kāi)安瓿，用吸管將細胞轉移到含有 5 ml 完全 MEM-10 培養基的 25 cm2 組織培養瓶中，輕輕搖動(dòng)培養瓶，使細胞均勻分布于培養瓶中，放入 5% CO2 加濕培養箱中 37℃ 培養過(guò)夜。

3. 將培養基吸出，用 0.5 ml 37℃ 的胰酶/EDTA 覆蓋細胞，消化 30～40 s。

4. 加入 10 ml 旋轉瓶完全培養基-5，并將細胞轉移至 50 ml 的離心管中。室溫 1800 g 離心 5 min，棄上清。

5. 將細胞沉淀懸浮在 5 ml 的旋轉瓶完全培養基-5 中，上下吹打，將細胞團打散。

6. 在 100 ml 或 200 ml 通氣旋轉瓶中加入 50 ml 旋轉瓶完全培養基-5，并將細胞懸液轉移到瓶中。

7. 取出 1 ml 細胞懸液，用血細胞計數器（附錄 3F) 進(jìn)行細胞計數。加入適量的旋轉瓶完全培養基-5，使細胞密度為（3～4）× 105 細胞/ml。將細胞放入無(wú) CO2 培養箱，37℃ 旋轉培養。

8. 隨后的兩天讓細胞繼續生長(cháng)，并且每天對細胞進(jìn)行計數，加入適量的旋轉瓶完全培養基-5 以維持（3～4）×105 細胞/ml 的細胞密度。

9. 取 1 ml 的細胞懸液，用血細胞計數器對細胞進(jìn)行監測。

10. 當細胞密度達到（4～5）×105 細胞/ml 時(shí)，隔天或每天用培養基將細胞稀釋至 1.5×105 或 2.5×105 細胞/ml。

11. 分別將裝有 50 ml 或 100 ml 細胞懸液的 100 ml 或 200 ml 通氣旋轉瓶放入 37℃ 無(wú) CO2 培養箱旋轉培養。每天或隔天傳代。

注意事項： 由于有些細胞是不能被養活的，所以需要高的初始密度。

其他：HeLa S3 細胞用旋轉瓶完全培養基-5 在通氣旋轉瓶中于 37℃ 無(wú) CO2 培養箱生長(cháng)和維持。細胞用新鮮的旋轉瓶完全培養基-5 每天或隔天進(jìn)行稀釋?zhuān)员３旨毎拿芏葹椋?.5～5）×105 細胞/ml。

細胞活力的測定

(1)相差顯微術(shù)法 在顯微鏡下， 根據細胞質(zhì)環(huán)流和正常細胞核的存在與否，即可鑒別出細胞的死活。 利用相差顯微鏡可以得到更明顯的圖象，但在亮視野顯微鏡下常常也不難進(jìn)行這樣的觀(guān)察。

(2)二乙酸熒光素 (FDA) 法： 應用這種方法可以對活細胞百分數進(jìn)行快速的目測 , 首先用丙酮制備 0.5%的 FDA 貯備液 , 置 0℃下保存。當要測定細胞活力時(shí)， 將貯備液加到細胞懸浮液中， 加入的數量以使最終濃度為 0.01%為準?；靹?，在室溫下作用 5 分鐘，然后在帶有適當的激發(fā)濾片和吸收濾片的熒光顯微鏡進(jìn)行觀(guān)察。FDA本身無(wú)熒光、無(wú)極性，可自由透過(guò)細胞質(zhì)膜進(jìn)入內部，進(jìn)入后由于受到活細胞內脂酶的分解，而產(chǎn)生有熒光的極性物質(zhì)熒光素， 它不能自由出入質(zhì)膜。 在熒光顯微鏡下可觀(guān)察到產(chǎn)生熒光的細胞， 表明是有活力的細胞； 相反，不產(chǎn)生熒光的細胞，表明是無(wú)活力的死細胞。 細胞活力以發(fā)綠色熒光的活細胞數占總觀(guān)察細胞數的百分數表示。

(3)伊文思蘭染色法：這種方法可用做FDA的互補法。當伊文思蘭的稀薄溶液 (0.025%)對細胞進(jìn)行短時(shí)間的處理， 只有活力已受損傷的細胞能夠攝取這種染料， 而完整的活細胞不能攝取這種染料。 因此，凡不染色的細胞皆為活細胞。 但是染色時(shí)間不能太長(cháng)， 否則活細胞也會(huì )逐漸積累染料而染成顏色。 細胞活力以未染色的活細胞數占總觀(guān)察細胞數的百分數表示。

實(shí)驗問(wèn)答

問(wèn)：懸浮細胞一般幾天離心一次，覺(jué)得好難養??！求心得？

答：你養的是什么細胞，原代嗎？我覺(jué)得懸浮細胞最好養了，不用消化，關(guān)于幾天離一次心，要看你的細胞生長(cháng)狀態(tài)了，我養過(guò)血液腫瘤細胞，增值比較快，我一般是第二天半量換液（加等量培養基后一分二），第三天若長(cháng)得比較滿(mǎn)，就離心換液。若你不想每天都去管它，你可以把細胞密度中的相對稀一點(diǎn)（不能太稀，太細了細胞不好好長(cháng)），可以2-3天換一次液（半量，不用離心），這要看細胞狀態(tài)，和你試驗進(jìn)度，若你急著(zhù)用細胞，那就將細胞中密一點(diǎn)，天天換液，用胎牛血清，這樣細胞會(huì )瘋長(cháng)的。要是比較嬌氣的細胞，象RPMI-8226，一定要用胎牛血清，2-3天半量換液，依據細胞狀態(tài)再離心換液，等細胞進(jìn)入對數生長(cháng)期了，養起來(lái)也就好養了。若是正常人T細胞，也要3-5天換一次液，最好3天的時(shí)候加入些新培養基，我曾經(jīng)有一次1周忘了換液（因為T(mén)細胞增殖很慢，或者說(shuō)在體外不給刺激基本不增殖，所以培養基的顏色不發(fā)生改變，但它也消耗營(yíng)養），最后作流式發(fā)現細胞大部分凋亡和死亡了。