目的： 構建特異性抑制大鼠Raf-1基因的重組腺病毒載體,并將其體外轉導大鼠心肌細胞中進(jìn)行功能鑒定。

　　方法： 合成針對大鼠Raf-1的靶序列及陰性對照序列,經(jīng)退火形成的DNA雙鏈定向克隆到穿梭質(zhì)粒pAdTrackCMV中獲得pAdTrack-siRaf-1質(zhì)粒,PmeI線(xiàn)性化后在BJ5183細菌中與pAdEasy-1骨架質(zhì)粒進(jìn)行同源重組獲得pAd-siRaf-1質(zhì)粒,后轉染HEK293細胞,包裝獲得pAd-siRaf-1腺病毒顆粒,繼而感染原代培養的心肌細胞,通過(guò)Western blot方法檢測siRNA對Raf-1、NF-κB基因的抑制效率,液體閃爍計數儀測定3H-亮氨酸([3H]-leu)摻入率,用HJ2000圖像分析系統測定細胞表面積。

　　結果： 重組腺病毒載體經(jīng)酶切、鑒定正確,制備的病毒感染效率高,攜帶Raf-1的病毒顆粒能夠在蛋白水平有效抑制Ang Ⅱ誘導心肌細胞Raf-1的表達、細胞表面積及[3H]-leu的增加并下調Raf-1、NF-κB表達。

　　結論： 成功構建了pAd-siRaf-1重組腺病毒載體,并在HEK293細胞中包裝成重組腺病毒,轉染心肌細胞后能有效抑制Raf-1、NF-κB表達,抑制Ang Ⅱ誘導的心肌細胞肥大。