一、亞硫酸氫鈉修飾過(guò)程中可能出現的問(wèn)題及應對措施
亞硫酸氫鈉修飾DNA的目的是將DNA序列中未甲基化的胞嘧啶完全轉化為尿嘧啶，而甲基化的5一甲基胞嘧啶保持不變。影響此過(guò)程的主要因素有修飾試劑的濃度、反應溫度、反應環(huán)境的pH值及反應時(shí)間。其中任何一個(gè)環(huán)節出現問(wèn)題都將導致MSP擴增失敗，體會(huì )如下：
(1)亞硫酸氫鈉的濃度最好控制在3．0～3．9 mol/L為好，其pH值必須用NaOH精確調整至5．0；
(2)修飾時(shí)間應掌握在10～16 h，修飾時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )導致甲基化胞嘧啶也會(huì )轉化成尿嘧啶且DNA模板破壞加劇，而時(shí)間過(guò)短會(huì )導致修飾不徹底；
(3)反應溫度應控制在50～55℃(若用國產(chǎn)恒溫水浴箱建議溫度設定在53℃為好)；
(4)DNA模板量應控制在<2ug為宜。
只要遵循以上幾點(diǎn)基本上能保證99％ 未甲基化的胞嘧啶轉化尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。但是，此修飾過(guò)程中模板DNA有約96％已經(jīng)降解 。當DNA樣品較少時(shí)(如石蠟包埋組織、血清DNA)，在純化回收時(shí)可加人適量鮭魚(yú)精DNA或糖原(約1g)作為載體，有利于DNA沉淀(加入載體后輕輕晃動(dòng)Ependof管可見(jiàn)絮狀DNA富集現象) 。
二、甲基化特異PCR可能出現的問(wèn)題與對策
1．引物因素分析MSP的引物設計的質(zhì)量是擴增成敗的關(guān)鍵性因素。
MSP的引物設計與普通的PCR引物設計不同，MSP的引物設計原理是：模板DNA在經(jīng)過(guò)亞硫酸鹽處理后，發(fā)生甲基化的基因啟動(dòng)子區域CpG島內CpG位點(diǎn)5 一端胞嘧啶保持不變；而未發(fā)生甲基化的CpG島內CpG位點(diǎn)5 一端胞嘧啶轉化為尿嘧啶，即C—U。針對修飾前后的序列差異用MethPrimer軟件設計甲基化與未甲基引物，進(jìn)行PCR擴增。MSP的引物序列中至少含有1個(gè)以上CpG位點(diǎn)，最好是含有多個(gè)CpG位點(diǎn)，這樣可保證引物的特異性，同時(shí)可以提高DNA啟動(dòng)子甲基化堿基的檢出率。MSP的引物必須按亞硫酸氫鈉處理后的DNA序列設計，同時(shí)也應該盡可能與普通PCR的引物設計原則相符合。按MSP的要求，任意DNA序列在做MSP擴增時(shí)，至少要合成2對引物，即甲基化引物與未甲基化引物。在MSP的未甲基化引物序列中前導引物不含鳥(niǎo)嘌呤堿基，反向引物不含胞嘧啶堿基。初涉及MSP者最好用文獻引物進(jìn)行研究。如果是為了篩選新的甲基化的抑癌基因而文獻中無(wú)法找到的相應MSP引物，可用在線(xiàn)MethPrimer軟件在線(xiàn)設計引物，網(wǎng)址為http：根據軟件提示可以找到所需要的MSP引物。但MSP所遇到的困難是，要擴增的是啟動(dòng)子或部分第一外顯子序列，其CG含量相對較高，MSP擴增難度加大，因此設計好的引物最好用引物軟件如Primer5．0從理論上推測其擴增效率，對于擴增效率<30％ 的引物要進(jìn)行優(yōu)化，方法是：在核心啟動(dòng)子區域前后反復調整甲基化前導引物擴增起始點(diǎn)，以期使引物擴增效率增高，降低擴增難度，從而提高PCR產(chǎn)量。
2．MSP的反應體系問(wèn)題MSP的反應體系的成分與普通PCR一樣，反應體系的優(yōu)化也與普通類(lèi)似，反應體系的優(yōu)化與普通PCR的反應體系中最大的區別是DNA模板不同。經(jīng)過(guò)修飾后的模板為單鏈狀態(tài)，MSP的DNA模板在抽提后應檢測其純度和含量，其純度要求A260／A280在1．8～2．0之間；其含量要準確檢測，否則在亞硫酸鹽處理時(shí)因DNA模板加的太多而導致DNA處理不完全而導致MSP擴增失??；而加的DNA模板太少則一方面浪費試劑，另一方面會(huì )因為目的片段太少導致MSP假陰性。Mg“濃度一般在2．0～2．5 mmoL／L為宜，過(guò)低過(guò)高都不利于擴增。此外，PCR的緩沖液及Taq酶的來(lái)源也很重要，一般的PCR緩沖液常常會(huì )導致結果不穩定，不同來(lái)源的Taq酶也會(huì )影響結果的重復性。我們建議用Taka—ra公司針對富含CG等復雜二級結構模板的TaKaRa IATaq with GC Buffer效果較好。而一旦選用某一廠(chǎng)家Taq酶后，不要輕易更換，以免MSP因重新優(yōu)化而引起的時(shí)間和成本的浪費。
3．MSP的反應溫度分析MSP擴增的結果有3種情況：(1)產(chǎn)物電泳為陰性；(2)產(chǎn)物電泳出現多條非特異性條帶(含目的基因條帶)；(3)產(chǎn)物電泳為陽(yáng)性(僅目的基因條帶)。出現前2種情況時(shí)，可在保證反應體系和引物沒(méi)有問(wèn)題的情況下，通過(guò)調整MSP的反應溫度而得到目的基因帶。方法如下：PCR反應中，Tm的高低與CG含量呈正相關(guān)。因甲基化與未甲基化引物序列差異，在擴增過(guò)程中可能會(huì )出現PCR偏性。我們建議，提高預變性溫度(一般應>95。C，10 rain)和變性溫度(>95℃ ，1 min)，退火溫度以60℃作梯度或70℃作降落PCR。
總之，在MSP全過(guò)程中，影響結果的因素較普通PCR要多得多，只要對實(shí)驗過(guò)程每一步認真控制可完全提高M(jìn)SP的準確度和精密度。
對于該文章的一些觀(guān)點(diǎn)，我也提出一些意見(jiàn)大家作為一些研究討論。
(1)亞硫酸氫鈉的濃度最好控制在3．0～3．9 mol/L為好。（我們實(shí)驗室就答亞硫酸鹽就大于這個(gè)濃度）
(2)修飾時(shí)間應掌握在10～16h，修飾時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )導致甲基化胞嘧啶也會(huì )轉化成尿嘧啶且DNA模板破壞加劇，而時(shí)間過(guò)短會(huì )導致修飾不徹底。（這點(diǎn)我深有體會(huì )，因為如上所述，我當時(shí)也懷疑4h可能修飾不完全，分別就做了6h,12h,16h.確實(shí)發(fā)現修飾時(shí)間過(guò)長(cháng)，模板破壞加劇，可能不倒2個(gè)星期就降解了，當時(shí)P處M的，后來(lái)居然只能P出U.
(3)DNA模板量應控制在<2 g為宜。(這個(gè)我想大家應該都理解，主要是為了修飾完全）
（本文轉載丁香通）
