多聚酶聯(lián)反應（PCR）可對特定基因進(jìn)行擴增，因此被廣泛應用于獲取特定基因或基因片段及臨床基因診斷等領(lǐng)域。早期最成功及普及的應用領(lǐng)域是獲取某一目的基因，用于基因診斷有許多局限性，主要有兩點(diǎn)，一是不能準確定量；二是由于太靈敏，容易交叉污染，產(chǎn)生假陽(yáng)性。為克服上述不足，人們采取了許多方法，如雜交法、競爭法、酶聯(lián)法及尿苷酶降解法等，但均不很成功，直到最近熒光能量傳遞技術(shù)（FRET）就用于PCR定量后上述問(wèn)題才得到較好的解決。本文綜述目前國內外幾種熒光定量PCR的原理及應用現狀。
1.TaqMan
TaqMan技術(shù)是PE公司開(kāi)發(fā)的，目前已開(kāi)始應用于基因檢測。該技術(shù)的基本原理見(jiàn)圖1。它利用了Taq酶的5’外切酶活性，合成一個(gè)能與PCR產(chǎn)物雜交的探針，該探針的5’端標記一個(gè)熒光分子，3’標記另一個(gè)熒光分子。其中3’端熒光分子能夠吸收5’端熒光分子發(fā)出的熒光，因此正常情況下該探針檢測不到的5’端熒光分子發(fā)出的熒光，只能檢測到3’端熒光分子的熒光信號，但當溶液中有PCR產(chǎn)物（模板）時(shí)，該探針與模板結合，激活Taq酶的5’外切酶活性，將探針5’端連接的熒光分子從探針上切割下來(lái)，從而發(fā)出熒光，切割的熒光分子數與PCR產(chǎn)物的數量成比例。因此根據PCR反應液的熒光強度即可計算出初始模板的數量。其主要不足是：（1）采用熒光淬滅及雙末端標記技術(shù)，因此淬滅難以徹底，本低較高；（2）采用酶外切活性，因此定量時(shí)受酶性能影響；（3）探針標記成本較高，不便普及應用。TaqMan技術(shù)在HCV病人血清HCV RNA定量分析及基因遺傳突變分析等領(lǐng)域有廣泛應用。
2.Amplisensor(Biotronics)
Amplisensor也是一種復合探針技術(shù)，一個(gè)探針上連接一種熒光物，另一探針連接一淬滅物。兩探針長(cháng)度不同，其中一種探針5’端多出7個(gè)堿基（GCGTCCC）。PCR擴增前需將此探針與PCR引物連接，PCR引物的5’末端應有一端與長(cháng)探針互補的序列，以便連接酶將引物與探針連接。擴增時(shí)該探針一引物復合物中的代引物部分作為半套式引物參入到模板，從而釋放出淬滅探針部分，破壞了FRET，而產(chǎn)生熒光。熒光的強度與擴增時(shí)加入的模板數成正比。該方法的主要特點(diǎn)；（1）由于采用了半套式PCR擴增可提高靈敏度，但無(wú)法區分因引物二聚體形成產(chǎn)生的非特異擴增信號，這樣定量準確度受影響；（2）每次PCR反應前，要先進(jìn)行Amplisensor的標記，增加了操作步驟和檢測成本；（3）中間需要加入半套式引物，增加污染機會(huì )。
后來(lái)有人對上述方法進(jìn)行了改進(jìn)，將合成時(shí)將熒光探針的3’末端。這種改進(jìn)雖然省去了PCR擴增前的連接步驟，但仍無(wú)克服非引物二聚體等非特異擴增信號對定量結果產(chǎn)生的影響。
3.Molecular beacon
分子信標技術(shù)也是在同一探針的兩末端分別標記熒光分子和淬滅分子，與TaqMan探針不同的是，該探針5’和3’末端自身可形成—8個(gè)堿基左右的發(fā)卡結構，此時(shí)熒光分子和淬滅分子鄰近，因此不會(huì )產(chǎn)生熒光。當溶液中有特異模板時(shí)該探針與模板雜交，從而破壞了探針的發(fā)卡結構即FRET，于是溶液便產(chǎn)生熒光，熒光的強度與溶液中探針的量成正比，因此可用于PCR定量分析，該方法的特點(diǎn)是采用非熒光染料作為淬滅分子，因此熒光合成時(shí)標記較復雜。分子信標技術(shù)結合不同熒光標記可用于基因多突變位點(diǎn)同時(shí)分析，如結核桿菌耐藥基因rpoB的耐藥分析。
后來(lái)，Nazarenko等基于MB的原理，使用了一種發(fā)卡引物式引物（Sunrise primer）,這一方法的特點(diǎn)是所有的擴增產(chǎn)物均能標記上熒光分子，因此熒光信號響反快，但無(wú)法共分特異和非特異擴增是其致命的不足。
最近 Whitcombe等上述方法進(jìn)行了改進(jìn)，發(fā)明了一種稱(chēng)之為蝎狀引物（scorpion primer）的熒光定量PCR技術(shù)，該技術(shù)在引物與MB探針之間連接一個(gè)間隔臂，使PCR延伸反應時(shí)不能夠延伸至MB分子，這樣非特異擴增產(chǎn)物便無(wú)熒光信號，但當有特異擴增產(chǎn)物時(shí)MB即可與擴增產(chǎn)物進(jìn)行分子內雜交，產(chǎn)生熒光信號。既解決了非特異問(wèn)題，又保留了其響應快的特點(diǎn)。但是仍存在雜交時(shí)探針不能完與模板匹配及合成復雜的問(wèn)題。該方法已成功地就髟于k-ras及BRAC2基因的突變分析.
4.Lightcycler
LightCycler是Roche公司新近開(kāi)發(fā)的一種PCR定量技術(shù)，該技術(shù)的特點(diǎn)也是將熒光分子和淬滅分子分別標記在兩個(gè)不同的探針上，產(chǎn)生發(fā)光探針和淬滅探針，發(fā)光探針的5’端連接熒光分子；淬滅探針的3’端連接熒光分子。由于兩探針設計時(shí)可與模板同一條鏈相鄰的序列雜交，雜交時(shí)兩探針的熒光分子和淬來(lái)分子便緊密相鄰，從而發(fā)生FRET而使熒光淬滅。熒光淬滅的程度與起始模板的量成反比，以此可以進(jìn)行PCR定量分析。該方法的特點(diǎn)是淬滅效率高，但由于兩個(gè)探針結合于模板上因此影響擴增效率，此外由于需要合成兩個(gè)較長(cháng)的探針，因此合成成本相對較高。
（本文轉載丁香通）
