一、防止RNA酶污染的措施
1. 所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長(cháng)時(shí)間。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用)。
3. 有機玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室溫10min,然后用0.1% DEPC水沖洗,晾干。
4. 配制的溶液應盡可能的用0.1% DEPC,在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑,應當用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制,然后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌。
5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套,實(shí)驗過(guò)程中手套要勤換。
6. 設置RNA操作專(zhuān)用實(shí)驗室,所有器械等應為專(zhuān)用。
二、常用的RNA酶抑制劑
1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過(guò)和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質(zhì)變性,從而抑制酶的活性。
2. 異硫氰酸胍:目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑,它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來(lái),又對RNA酶有強烈的變性作用。
3. 氧釩核糖核苷復合物:由氧化釩離子和核苷形成的復合物,它和RNA酶結合形成過(guò)渡態(tài)類(lèi)物質(zhì),幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin):從大鼠肝或人胎盤(pán)中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑,可以和多種RNA酶結合,使其失活。
5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。
因為DEPc不加選擇的修飾蛋白質(zhì)和RNA,因此在分離和純化RNA過(guò)程中不能使用,而且它與一些緩沖液(例如Tri)不能相容。
在所有RNA實(shí)驗中,最關(guān)鍵的因素是分離得到全長(cháng)的RNA。而實(shí)驗失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。
RNA酶可耐受多種處理而不被滅活,如煮沸、高壓滅菌等。
研究人員造成的污染 RNA酶最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此進(jìn)行RNA實(shí)驗時(shí)應勤換手套。
但DEPC能與胺和巰基反應,因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。
(本文轉載丁香通)