一、問(wèn)題：RT-PCR靈敏度：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒(méi)有RT-PCR產(chǎn)物。

可能原因：

1．RNA被降解

建議解決方法：

       在用來(lái)驗證完整性之前先在變性膠上分析RNA使用良好的無(wú)污染技術(shù)分離RNA；

       在將組織從動(dòng)物體取出后立刻處理在100％甲酰胺中儲存RNA；

       如果使用胎盤(pán)RNase抑制劑，不要加熱超過(guò)45℃或pH超過(guò)8.0，否則抑制劑或釋放所有結合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT時(shí)加入RNase抑制劑，一定要存在DTT。

2．RNA中包含逆轉錄抑制劑

建議解決方法：

       通過(guò)乙醇沉淀RNA除去抑制劑。用70％（v/v）乙醇對RNA沉淀進(jìn)行清洗?？梢约尤胩窃?.25μg到0.4μg/μl）以幫助小量樣品RNA的恢復。

       逆轉錄抑制劑包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸鈉，spermidine，甲酰胺和胍鹽。

       將對照RNA同樣品混合，同對照RNA反應比較產(chǎn)量以檢驗抑制劑。

3．多糖同RNA共沉淀

建議解決方法：

       使用氯化鋰沉淀RNA以除去多糖。

4．用于合成cDNA第一鏈合成的引物沒(méi)有很好退火

建議解決方法：

       確定退火溫度適合您的引物。對于隨機六聚體，建議在反應溫度保溫之前先在25℃保溫10分鐘。

       對于基因特異性引物（GSP），可以試一下其他GSP，或換用oligo(dT)或隨機六聚體.

       確定GSP是反義序列。

5．起始RNA量不夠

建議解決方法：

       增加RNA量。

       對于＜50ng的RNA樣品，可以在第一鏈cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。

6．RNA模板二級結構太多

建議解決方法：

       將RNA和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/退火.

       提高逆轉錄反應溫度，對SuperScriptⅡ可以到50℃，對ThermoScript可以到65℃。

注意：不要在＞60℃時(shí)使用oligo(dT)引物，選擇一個(gè)在反應溫度可以退火的GSP。對于＞1kb的RT-PCR產(chǎn)物，保持反應溫度≤65℃。

注意：不要在高于37℃時(shí)使用M-MLV。

       如果不需要全長(cháng)cDNA，在第一鏈反應中使用隨機引物。

7．引物或模板對殘余的RNA模板敏感

建議解決方法：

       在PCR前用RNaseH處理。

8．靶序列在分析的組織中不表達

建議解決方法：

       嘗試其他靶序列或組織

9．PCR沒(méi)有起作用

建議解決方法：

       對兩步法RT-PCR，不要在PCR步驟中使用超過(guò)1/5的逆轉錄反應產(chǎn)物。

二、問(wèn)題：PCR靈敏度：在瓊脂糖凝膠分析中看到少量或沒(méi)有RT-PCR產(chǎn)物。

可能原因：

1．PCR引物設計較差

建議解決方法：

       避免在引物3'端含有互補序列。避免可以形成內部發(fā)卡結構的序列。設計Tm類(lèi)似的引物。

2．DNA含有抑制劑

建議解決方法：

       諸如DMSO，SDS和甲酰胺之類(lèi)的試劑會(huì )抑制Taq DNA聚合酶。如果懷疑污染了抑制劑，可以使用乙醇沉淀DNA。

3．富含GC的模板

建議解決方法：

       對于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。

4．模板濃度太低

建議解決方法：

       使用104拷貝的靶序列，以在25到30個(gè)循環(huán)中獲得信號。

5．鎂離子濃度太低

建議解決方法：

       從1mM到3mM，間隔0.5mM進(jìn)行一系列反應，確定對于每個(gè)模板和引物對的最佳鎂離子濃度。注意：對實(shí)時(shí)定量PCR，使用3mM到5mM的鎂離子濃度。

6．退火溫度太高

建議解決方法：

       使用表4的公式估算Tm，把退火溫度設定為低于Tm 5℃。因為這些公式只是估算Tm值，所有真正的退火溫度實(shí)際會(huì )高些或低些。

7．引物濃度太低

建議解決方法：

       最佳引物濃度介于0.1μM到0.5μM之間。為了精確確定引物濃度，在260nm測量光密度，然后使用光吸收值和消光系數計算濃度。

三、問(wèn)題：RT-PCR特異性：在瓊脂糖凝膠分析中觀(guān)察到非預期條帶。

可能原因：

1．引物和模板非特異性退火

建議解決方法：

       在第一鏈合成中使用GSP，而不是隨機引物或oligo(dT)。

       試用允許高溫cDNA合成的GSP2．GSP設計較差

建議解決方法：

遵循用于擴增引物設計的同樣原則

3．RNA中沾染了基因組DNA

建議解決方法：

       使用擴增級DNaseⅠ處理RNA。使用沒(méi)有逆轉錄的對照反應檢測DNA污染。

四、問(wèn)題：PCR特異性：在瓊脂糖凝膠分析中觀(guān)察到非預期條帶。

可能原因：

1．形成引物二聚體。

建議解決方法：

       設計在3'端沒(méi)有互補序列的引物。

2．引物和模板非特異性退火

建議解決方法：

       以2℃到5℃間隔增加退火溫度，減少退火時(shí)間。

       在開(kāi)始幾個(gè)循環(huán)使用較高的退火溫度，然后使用較低的退火溫度。

       使用Platinum Taq DNA進(jìn)行自動(dòng)熱啟動(dòng)PCR。

       避免在引物3'端含有2到3個(gè)dG或dC。

3．鎂離子濃度太高

建議解決方法：

       對于每一個(gè)模板和引物組合優(yōu)化鎂離子濃度。

4．因為擴增復雜模板導致引物錯誤起始

建議解決方法：

       使用巢式PCR或遞減PCR。

5．沾染外源DNA

建議解決方法：

       使用抗氣霧劑的tip和UDG。

6．因為二級結構導致引物結合位點(diǎn)無(wú)法接近

建議解決方法：

       對于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）PCRx Enhancer Solution。

五、問(wèn)題：PCR忠實(shí)性：PCR在產(chǎn)物序列中引入了錯誤

可能原因：

1．聚合酶忠實(shí)性低

建議解決方法：

       使用帶有校正活性的熱穩定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。

2．循環(huán)數太多

建議解決方法：

       降低循環(huán)數。

3．四種dNTP的濃度不同

建議解決方法：

       制備新的dNTP混合物，保證四種核苷濃度相同。使用預混合物。

       （本文轉載丁香通）