PCR污染與對策
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發(fā)布時(shí)間：2017-11-17
PCR反應的最大特點(diǎn)是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭痛的問(wèn)題是易污 染，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生.
一、污染原因
(一)標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時(shí)，由于 密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提 取過(guò)程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠 或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染.
(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染.
(三)PCR擴增產(chǎn)物污染.這是PCR反應中最主要最常見(jiàn)的污染問(wèn)題.因為PCR產(chǎn)物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染，就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性.
還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩 擦時(shí)就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地搖動(dòng)反應管，開(kāi)蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣 槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由 其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題.
(四)實(shí)驗室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對照的 檢驗室，這個(gè)問(wèn)題也比較常見(jiàn).因為克隆質(zhì)粒在單位容積內含量相當高，另外在純化 過(guò)程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質(zhì)粒，由于活細胞的生長(cháng)繁殖的簡(jiǎn) 便性及具有很強的生命力.其污染可能性也很大.
二、污染的監測
一個(gè)好的實(shí)驗室，要時(shí)刻注意污染的監測，考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染.
對照試驗
1.陽(yáng)性對照:在建立PCR反應實(shí)驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽(yáng)性對照，它是PCR 反應是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標志.陽(yáng)性 對照要選擇擴增度中等、重復性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng) 性對照，其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下).但陽(yáng)性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng) 性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大.因而當某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩 定，檢驗人員心中有數時(shí)，在以后的實(shí)驗中可免設陽(yáng)性對照.
2.陰性對照:每次PCR實(shí)驗務(wù)必做陰性對照.它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用 鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照.②試劑 對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴增，以監測試劑是否污染.
3.重復性試驗
4.選擇不同區域的引物進(jìn)行PCR擴增
三、防止污染的方法
(一)合理分隔實(shí)驗室:將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定 等步驟分區或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應與其它步驟嚴格分開(kāi). 最好能劃分①標本處理區;②PCR反應液制備區;③PCR循環(huán)擴增區;④PCR產(chǎn)物鑒定區. 其實(shí)驗用品及吸樣槍?xiě)獙?zhuān)用.實(shí)驗前應將實(shí)驗室用紫外線(xiàn)消毒以破壞殘留的DNA或RNA.
(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問(wèn)題.由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸 入槍內或粘上槍頭是一個(gè)嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸 樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染.
(三)預混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應小量分裝，如有可能，PCR反應液應預先 配制好，然后小量分裝，-20℃保存.以減少重復加樣次數，避免污染機會(huì ).另外，PCR試劑，PCR反應液應與樣品及PCR產(chǎn)物分開(kāi)保存，不應放于同一冰盒或同一 冰箱.
(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用.
(五)設立適當的陽(yáng)性對照和陰性對照，陽(yáng)性對照以能出現擴增條帶的最低量的標準病 原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照 及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照.
(六)減少PCR循環(huán)次數，只要PCR產(chǎn)物達到檢測水平就適可而止.
(七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來(lái)核酸的進(jìn)入，打開(kāi)離心管前 應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部.開(kāi)管動(dòng)作要輕，以防管內液體濺出.
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