實(shí)驗方法原理
直接挑取菌落進(jìn)行PCR，PCR的95℃加熱可以破胞，釋放基因組DNA或質(zhì)粒，成為PCR體系的模板，然后進(jìn)行鏈式擴增。
實(shí)驗材料 基因樣品
試劑、試劑盒 dNTPPCR混合液
儀器、耗材 PCR儀
實(shí)驗步驟
1. PCR混合液的制備
（1）Taq buffer（10×） 180 ul
（2）dNTP（2.5 mM） 20~25 ul
（3）Primer Forward（引物濃度在10 Pmol） 5 ul
（4）Primer Reverse（引物濃度在10 Pmol） 5 ul
（5）ddH2O 147 ul
（6）Taq（2 U/ul） 12~15 ul
2. 常溫下隨機挑選轉化板上的轉化子，用滅菌的牙簽或槍頭挑取單個(gè)菌落（強調單個(gè)，不能是雙克?。?，在LB瓊脂糖平板上輕點(diǎn)，做一拷貝。
3. 然后將沾有菌體的牙簽或槍頭置于相應的裝有PCR管中或者96空pcr反應板（管子做好記號，如平板上點(diǎn)的是1#，則管子上也標1#，以便篩選到克隆后的擴到培養）。
4. 挑好單克隆菌落后將之前配制好的PCR混合液加入體系是30 ul。
5. 將混有菌體的PCR混合物置于PCR儀中，按常規條件擴增。
6. 將擴增出來(lái)的反應液中加入溴酚藍或是其他染料，電泳檢測是否得到目的片斷。如有則為陽(yáng)性克隆。
7. 將已經(jīng)接種有菌落的平板置37℃培養箱培養過(guò)夜，使菌落擴增。
8. 次日挑選陽(yáng)性克隆做進(jìn)一步篩選或培養。步驟2也可以不點(diǎn)板，直接接種搖菌，如果早上做PCR的話(huà)，下午就可以提質(zhì)粒，得到重組載體。
注意事項
1. 設計引物很關(guān)鍵。一般如果是定向克隆，用載體上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克?。ㄈ鐔蚊盖谢蚱侥┒诉B接），一條引物用載體，一條引物用目的基因上的，這樣就可以比較方便的鑒定了，而且錯誤概率很低。PCR條件的選擇接近最佳，同時(shí)挑取的菌體不宜太多，否則會(huì )有非特異性擴增。
2. 使用的引物濃度不能太高，濃度過(guò)高會(huì )導致非特異性擴增，反應的循環(huán)數也不能太多，一般不超過(guò)25個(gè)。同時(shí)因為擴增的片段的GC含量問(wèn)題，有的GC含量很低，有的又很高，導致菌落PCR不容易擴增出目的條帶，在此建議在設置PCR程序時(shí)以高GC的溫度為上限，每一循環(huán)降0.2度左右。（轉帖）
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