標本的制備

原位PCR技術(shù)可應用于細胞懸液、細胞涂片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而言，以懸浮的完整細胞做原位PCR效果最好，石蠟切片效果最差。

注意：要防上細胞、組織標本在原位PCR操作過(guò)程中脫落。

①承載標本的載玻片要涂以多聚賴(lài)氨酸或進(jìn)行硅烷處理；

②多聚賴(lài)氨酸用消毒蒸餾水配置，使濃度為lmg／ml；

③分裝后-20℃冰箱保存。

④涂片時(shí)先在載玻片的涂面用鉛筆或鉆石筆做上標記，再將一小滴PLL溶液（約5μl）滴在玻片上，用另一玻片的邊緣象制備血涂片那樣將PLL均勻地在玻片上涂上一薄層。

⑤1-2 min后，PLL薄層即干燥，玻片收藏備用。

組織細胞的固定

步驟：以10%的緩沖福爾馬林或4%的多聚甲醛固定后進(jìn)行原位PCR；

固定的時(shí)間：一般不宜過(guò)長(cháng)，視組織的大小，一般以4℃4-6小時(shí)為宜。 

預處理制備好的組織標本

原理：經(jīng)蛋白酶消化的組織細胞，可增加其通透性，充分允許反應體系中的各成分進(jìn)入細胞內，并能很好的暴露靶序列，以利于擴增。

常用的蛋白酶有：蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根據組織固定的程度進(jìn)行調整。

注意事項：蛋白酶消化后，要加熱以滅活酶的活性或通過(guò)充分的洗滌將酶完全去除，因為只要有少量的殘留酶存在，都將對隨后進(jìn)行的PCR反應體系的數量TaqDNA酶產(chǎn)生毀滅性的影響。 

原位擴增

原位擴增也即在組織細胞標本上進(jìn)行PCR反應，其基本原理及反應條件與液相PCR相同，但由于PCR是在固定的細胞組織標本上進(jìn)行，所以也有其特殊性。

1、引物：PCR所用的引物一般為15-30bp為宜，擴增的片斷為100-1000bp左右。原位PCR宜用較短的引物。在原位PCR組織標本制備過(guò)程中，DNA和RNA常有一定程度的降解。尤其是存檔組織的石蠟切片，DNA和RNA的降解就更明顯。從蠟塊組織中提取的DNA，很少超過(guò)400bp，RNA 則不超過(guò)200個(gè)堿基。

2、反應體系：原位PCR的反應體系與常規的液相PCR基本相同，由于是在經(jīng)過(guò)固定的組織切片上進(jìn)行，為獲得較好的擴增效果，有人主張反應體系中的引物，TaqDNA聚合酶以及Mg2+的濃度均應高于液相的PCR反應體系。在反應體系中要加入牛血清白蛋白（BSA）,以防止TaqDNA聚合酶與玻片的結合而降低了擴增效率。 

3、熱循環(huán)：原位PCR的熱循環(huán)可在專(zhuān)門(mén)的熱循環(huán)儀上進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便。也可在一般的PCR熱循環(huán)儀上進(jìn)行，通常在樣品臺上覆蓋一層鋁箔，制成平臺，樣品臺上的空間用礦物油或水充填，將載玻片至于平臺上，即可進(jìn)行熱循環(huán)的步驟。 

后處理

原位擴增結束后，標本應清洗，以除去彌散到細胞外的擴增產(chǎn)物。洗滌不充分，會(huì )導致擴增產(chǎn)物在檢測時(shí)顯現，造成背景過(guò)深或假陽(yáng)性結果的出現。但是，洗滌過(guò)度，也會(huì )造成細胞內擴增的產(chǎn)物被洗脫，是陽(yáng)性信號減弱或丟失。 

有的研究者在標本原位擴增后，用多聚甲醛（4％，2h）或戊二醛（2％，5 min）進(jìn)行后固定，以使擴增產(chǎn)物在隨后的檢測過(guò)程中能保留在細胞內，提高檢測的敏感性和特異性。要注意的是后固定應適度，過(guò)強的后固定會(huì )影響原位雜交檢測時(shí)探針與特異性擴增產(chǎn)物的結合。

原位檢測

原位PCR的擴增產(chǎn)物檢測方法，取決于原位PCR的設計方案，直接法則根據標記分子的性質(zhì)對擴增產(chǎn)物直接進(jìn)行原位檢測。間接法則需用原位雜交的方法進(jìn)行檢測