1) 測熒光信號的步驟有誤：一般 SG 法采用 72℃ 延伸時(shí)采集，Taqman 法則一般在退火結束時(shí)或延伸結束采集信號。

2) 引物或探針降解：可通過(guò) PAGE 電泳檢測其完整性。

3) 模板量不足：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣本的最高濃度做起。

4) 模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復凍融的情況。

Ct 值出現過(guò)晚（Ct >38）

1) 擴增效率低：反應條件不夠優(yōu)化。設計更好的引物或探針，改用三步法進(jìn)行反應。適當降低退火溫度，增加鎂離子濃度等。PCR各種反應成分的降解或加樣量的不足。

2) PCR 產(chǎn)物太長(cháng)： 一般采用 80-150 bp 的產(chǎn)物長(cháng)度。

Ct 值比較靠后

Ct 值比較靠后，對實(shí)驗有一定的影響，因為經(jīng)過(guò)那么多次的循環(huán)，酶的活性有可能有所下降，這時(shí)候擴增效率會(huì )有所改變（而定量 PCR 的理論基礎就是每次循環(huán)的擴增效率我們認為是確定的一個(gè)值）。因此最好能夠把 Ct 值往前移。解決辦法可以將模板加以濃縮或者抽干之后用少量水去溶解。

標準曲線(xiàn)的 slope 總大于４，每個(gè)梯度的平行 Ct 值差別大

這個(gè)斜率是＝1/LOG 10（擴增效率），理論上擴增效率＝2，斜率是 3.322。如果斜率大于 4，說(shuō)明擴增效率比較小?？梢钥疾橐幌路磻w系是否合理，酶活是否正常，試劑盒的質(zhì)量是否有保證。只有在引物和模板處于最適比例時(shí)才能得到比較滿(mǎn)意的擴增效率，因此通過(guò)調節 PCR 反應體系中的引物終濃度來(lái)解決，可以做一些引物梯度來(lái)比較。

平行管的 Ct 值差別大可以考查一下自己實(shí)驗操作是否規范，另外一種原因就是儀器本身的誤差也可能會(huì )導致 Ct 值差別比較大。

ROX 染料是什么作用

ROX 的作用 ABI 宣稱(chēng)是用來(lái)校準加樣誤差的。但是據說(shuō) ROX 的作用實(shí)際上是用來(lái)校準光程差的。即每個(gè)孔的熒光信號經(jīng)過(guò)濾光片在經(jīng)過(guò)聚焦到 CCD 的時(shí)候，走過(guò)的光程是不一樣的，這樣在 CCD 上成像的亮度就不一樣了。所以需要把這個(gè)差異用 ROX 來(lái)計算孔間差異有多大，然后差異系數去處理，實(shí)際的熒光信號。

如何確定熒光定量 PCR 的基線(xiàn)

基線(xiàn)就是背景值，因此就是曲線(xiàn)在沒(méi)有「起跳」之前的一段。在軟件上有一個(gè)地方可以輸入 baseline 從第幾到第幾 cycle 作為基線(xiàn)。設置原則是使沒(méi)有起跳之前最多的 cycle 的信號接近 0。

引物和探針對 Ct 值有什么影響

首先要保證引物能夠跟模板完全配對，第二，引物應該是過(guò)量的。第三，引物不應該形成引物二聚體。也說(shuō)白了就是要保證體系的擴增效率盡量地達到2并且沒(méi)有非特異性擴增。在保證這個(gè)前提之下引物對 Ct 值是沒(méi)有影響的。如果第一和第二沒(méi)有達到，應該 Ct 值會(huì )變大。如果第三沒(méi)有達到那么 Ct 值應該變小。探針應該與模板完全配對，并且有一定的長(cháng)度，濃度過(guò)量。保證探針能夠特異性地完全結合在模板上。