一、原理
AFLP也是通過(guò)限制性?xún)惹忻钙蔚牟煌L(cháng)度檢測DNA多態(tài)性的一種DNA分子標記技術(shù)。但AFLP是通過(guò)PCR反應先把酶切片段擴增，然后把擴增的酶切片段在高分辨率的順序分析膠上進(jìn)行電泳，多態(tài)性即以擴增片段的長(cháng)度不同被檢測出來(lái)。實(shí)驗中酶切片段首先與含有與其共同粘末端的人工接頭連接，連接后的粘末端順序和接頭順序就作為以后PCR反應的引物結合位點(diǎn)。實(shí)驗中，根據需要通過(guò)選擇在末端上分別填加了1～3個(gè)選擇性核苷的不同引物，可以達到選擇性擴增的目的。這些選擇性核苷酸使得引物能選擇性地識別具有特異配對順序的內切酶片段，進(jìn)行結合，導致特異性擴增。
二、實(shí)驗試劑
Taq酶 EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI接頭 E+A引物M+C引物T4DNALigaseE和M引物瓊脂 過(guò)硫酸胺丙烯酰胺尿素硝酸銀甲酰胺 dNTPs 二甲苯青 冰醋酸玻璃硅烷50bpMark
三、操作步驟
1. 基因組DNA提取和純化
DNA的純化：用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5 μg/ml）電泳檢測片段大小，取出其中的1/3已提取的基因組DNA進(jìn)行純化，首先用TE緩沖液補滿(mǎn)至總體積50ul，再等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）、氯仿/異戊醇（24∶1）各抽提一次， 離心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10體積的NaAC和二倍體積預冷的無(wú)水乙醇，－20℃放置2 h以上，10000 g 離心10 min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次 ，風(fēng)干后溶于30 μl TE緩沖液中，UV-2401PC（島津）紫外分光光度計檢測A260、A280值并定量，再用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5 μg/ml）電泳檢測片段大小。
注：0.1-0.2g組織可用100ul溶液E溶，0.5g組織，溶液E可增加至300 ul，此時(shí)DNA濃度大約為100 ng/ul。
2. 限制性酶切及連接在0.2 ml 離心管中加入：模板量約為250 ng，2.5 μl 10×酶切緩沖液， 2.5 μl 10×T4DNA連接酶切緩沖液，5 U EcoRⅠ， 5 U MseⅠ，2 U T4連接酶，50 pmol MseⅠ接頭（序列見(jiàn)表2），雙蒸水補至25 μl。用PE公司PCR擴增儀設定37℃過(guò)夜反應后，于65℃20 min滅酶活，-20℃保存，作為預擴增模板。
3. 預擴增取3 μl 酶切連接產(chǎn)物，加入75 ng E+A，75 ng M+C引物，15 mmol/L Mg2+，25 mmol/L dNTPs，1 U Tag酶，3 μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補至30 μl。反應參數為：94℃90 s；94℃30 s，56℃1 min，72℃1 min，30循環(huán)；72℃10 min。反應結束后，用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5 μg/ml）電泳檢測擴增產(chǎn)物，取3 μl 產(chǎn)物釋稀50倍，用作選擇性擴增模板。
4. 選擇性PCR擴增取釋稀后的產(chǎn)物3 μl，加入EcoRⅠ選擇性引物、MseⅠ選擇性引物各75ng，15 mmol/L Mg2+，25 mmol/L dNTPs，1 UTag酶，3 μl 10×PCR緩沖液，加雙蒸水補至30 μl。反應參數為：94℃90 s；94℃30 s，65℃1 min，72℃1 min，13循環(huán)（每循環(huán)降0.7℃）；94℃30 s， 56℃1 min，72℃1 min，25循環(huán)；72℃5 min，先用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5 μg/ml）電泳檢測先擇性擴增產(chǎn)物。
5. 凝膠電泳擴增產(chǎn)物用6%變性聚丙烯酰胺膠（厚度0.5 mm）和1×TBE電泳緩沖液電泳分離。拔出梳子，140 W 恒功率預電泳30分鐘，溫度達到47～49℃。務(wù)必使每個(gè)孔清洗出尿素。選擇性擴增產(chǎn)物中加入等體積上樣緩沖液（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.25%二甲苯青，0.25%溴酚藍）94℃變性5 min，結束后迅速置于冰上直到點(diǎn)樣。每個(gè)泳道加樣8 μl。一開(kāi)始用100 W 恒功率電泳約2分鐘，使樣品迅速集中到孔底部，再調到60W恒功率電泳，溫度保持在43℃左右，至二甲苯青FF至玻璃板2/3處，結束電泳。
6. 銀染固定液：取100 ml冰醋酸到900ml去離子水或雙蒸水中。染色液：1 g AgNO3 ，1.5 ml 37% 甲醛，加去離子水至1L。顯色液：30g Na2CO3，1.5 ml 37% 甲醛，2 mg硫代硫酸鈉，加去離子水至1L。
（1）電泳完畢后，將粘有凝膠的玻璃板置入用于銀染的塑料盤(pán)中。
（2）固定：加入固定液，在搖床上輕微震蕩30 min。固定結束后，固定液保留。
（3）加入去離子水漂洗3次，每次2 min。
（4）染色：將凝膠放入染色盤(pán)中，倒入染色液（4℃），在搖床上輕微震蕩30 min。用去離子水漂洗凝膠10秒鐘后，置入顯色盤(pán)中。
（5）顯色：加入顯色液（4℃），在搖床上輕微震蕩直至條帶數不再增加為止。
（6）終止：加入固定液，來(lái)回漂幾分鐘。達到最好效果后，用蒸餾水漂洗幾分鐘。
（7）去除凝膠和玻璃板上的水珠后，放在白光燈箱上用Nikon數碼相機拍照。
7. 數據分析用BIO-RAD公司的Quantity One 軟件統計，再用NTSYS軟件計算出遺傳相似性系數，用UPGMA法進(jìn)行聚類(lèi)分析構建聚類(lèi)圖。（轉帖）
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