原位PCR簡(jiǎn)介

原位PCR技術(shù)的基本原理，就是將PCR技術(shù)的高效擴增與原位雜交的細胞定位結合起來(lái)，從而在組織細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。 

原位PCR技術(shù)成功地將PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)結合起來(lái)，保持了兩項技術(shù)的優(yōu)勢又彌補了各自的不足。原位PCR技術(shù)的待檢標本一般先經(jīng)化學(xué)固定，以保持組織細胞的良好形態(tài)結構。細胞膜和核膜均具有一定的通透性，當進(jìn)行PCR擴增時(shí)，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進(jìn)入細胞內或細胞核內，以固定在細胞內或細胞核內的RNA或DNA為模板，于原位進(jìn)行擴增。擴增的產(chǎn)物一般分子較大，或互相交織，不易穿過(guò)細胞膜或在膜內外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細胞內單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數極擴增，擴增的產(chǎn)物就很容易被原位雜交技術(shù)檢查。 

基本類(lèi)型

根據在擴增反應中所用的三磷酸核苷原料或引物是否標記，原位PCR技術(shù)可分為直接法和間接法兩大類(lèi)，此外，還有反轉錄原位PCR技術(shù)等。

引物設計

1、直接法原位PCR技術(shù) 

直接法原位PCR技術(shù)是將擴增的產(chǎn)物直接攜帶標記分子，即使用標記的三磷酸腺苷或引物片斷。當標本進(jìn)行PCR擴增時(shí)，標記的分子就摻入到擴增的產(chǎn)物中，顯示標記物，就能將特定的DNA或RNA在標本（原位）中顯現出來(lái)。 
常用的標記物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自顯影的方法或用親和組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)的方法去顯示標記物所在位置。 

2、間接法原位PCR技術(shù) 

間接法原位PCR技術(shù)師現在細胞內進(jìn)行特定DNA或RNA擴增，再用標記的探針進(jìn)行原位雜交，明顯提高了特異性，是目前應用最為廣泛的原位PCR技術(shù)。 

3、原位反轉錄PCR技術(shù)

原位反轉錄PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是將液相的RT-PCR技術(shù)應用到組織細胞標本中的一種新技術(shù)，與RT-PCR（液相）不同點(diǎn)在于，進(jìn)行原位反轉錄PCR反應之前，組織標本要先用DNA酶處理，以破壞組織中的DNA酶，這樣才能保證擴增的模板是從mRNA反轉錄合成的cDNA，而不是細胞中原有的DNA。其它基本步驟與液相的RT-PCR相似。

原位PCR技術(shù)的應用 

原位PCR技術(shù)能在組織細胞原位檢測出拷貝數較低的特異性基因序列。按照待測基因的性質(zhì)，可將原位PCR的應用分為檢測外源性基因和內源性基因兩方面。 

1、用于外源性基因的檢測：病毒基因的檢測、細菌基因的檢測 、導進(jìn)基因的檢測 
 

2、 用于內源性基因的檢測：異?；虻臋z測、固有基因的檢測