一、主要實(shí)驗步驟如下： 

      1、設計并合成 Realtime PCR 引物。 

      2. 引物溶解后使用 Promega 的 TaqDNA 聚合酶進(jìn)行含 SG（SYBR?； Green）的 PCR 反應的優(yōu)化。 

      3. 客戶(hù)樣品 RNA 抽提 。

      a.實(shí)驗對象為組織樣品，取適量（50-100 mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加 1 ml 的 RNA 抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提 RNA。 

      b.實(shí)驗對象為細胞樣品，每份樣品取 1×106～1×107 細胞，PBS 清洗細胞，去 PBS 加 1 ml 的 RNA 抽提試劑 Trizol（Invitrogen），裂解后抽提 RNA 。

      4. RNA 質(zhì)量檢測  

      a. 紫外吸收測定法測定 RNA 在分光光度計 260 nm 和 280 nm 處的吸收值，以計算其濃度并評估 RN A純度 。

      b. 使用甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。 

      5. 使用逆轉錄酶（Promega）進(jìn)行反應，將樣品RNA逆轉錄為cDNA。 

      6. 制備標準曲線(xiàn)樣品： 

      7. 標準曲線(xiàn)樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應液中，進(jìn)行RealTime PCR擴增和檢測。 

      8. 檢測結果進(jìn)行標準曲線(xiàn)分析：以對待測樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對定量實(shí)驗需要進(jìn)一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差，所得結果代表某樣品的目的基因相對含量。 

      9. 提供實(shí)驗報告：包括詳細的實(shí)驗方法及實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 實(shí)驗結果的相關(guān)圖表 。

      CT值：熒光信號有統計意義顯著(zhù)增長(cháng)(即穿過(guò)閾值線(xiàn))時(shí)的循環(huán)次數，或者說(shuō)是從基線(xiàn)到指數增長(cháng)的拐點(diǎn)所對應的循環(huán)次數。

      閾值：閾值的默認設置是 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號的標準偏差的 10 倍。