PCR-SSCP原理和操作步驟
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-20
PCR-SSCP是1989年日本Orita等創(chuàng )建的篩查突變的新技術(shù)。它是一種簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟的點(diǎn)突變篩查手段。PCR-SSCP技術(shù)的基本原理是PCR擴增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈DNA，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)形成不同的立體構象，其構象直接影響泳動(dòng)速率，相同長(cháng)度的 DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個(gè)堿基的差別，就可以產(chǎn)生立體構象的不同，造成泳動(dòng)速率的不同，產(chǎn)生不同的泳動(dòng)帶。
PCR擴增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈后在不含有變性劑的中性膠中電泳，與正常比較出現泳動(dòng)帶的變位即可推測存在堿基置換。其堿基置換的性質(zhì)必須經(jīng)過(guò)DNA測序才能確定。因此PCR-SSCP檢測是測序之前突變篩查的常用手段。
為了便于觀(guān)察分析結果，PCR擴增體系中常加入a-32P dNTP標記PCR產(chǎn)物，電泳后放射自顯影觀(guān)察泳動(dòng)帶的位置。目前也常用銀染法來(lái)染色聚丙烯酰胺凝膠上的DNA泳動(dòng)帶，此方法可避免同位素的污染及對操作者的輻射損傷，但其靈敏度不如用同位素標記。
單鏈DNA片段的立體構象主要與堿基序列相關(guān)，但也受到其他條件的影響。因此，PCR-SSCP技術(shù)的關(guān)鍵在于電泳時(shí)的諸多條件，如凝膠的組成、電泳的溫度、離子濃度以及影響分子內相互作用的其他溶質(zhì)等。
PCR-SSCP的缺點(diǎn)是存在假陰性和假陽(yáng)性，一般對長(cháng)度不超過(guò)300bp的待測片段的檢出率為70~80%。
步驟
1. PCR反應（同前）
PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳確認。
2. PCR反應結束后，取5μl擴增產(chǎn)物加10μl甲酰胺上樣緩沖液混勻，98℃ 變性10分鐘，迅速冰浴。
3. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。
（1）制備50 ml 6%非變性聚丙烯酰胺凝膠，加 TEMED 25 μl、10%過(guò)硫酸銨250 μl，混勻后灌膠，插入加樣梳子。待膠完全聚合后，拔出加樣梳子，安裝電泳裝置，加入1′TBE電泳緩沖液，緩沖液應高于加樣孔上緣，用注射器吸取緩沖液沖凈加樣孔。
（2）取已變性的5 μl PCR擴增產(chǎn)物加到點(diǎn)樣孔中，以20 V/cm 電泳 4~5小時(shí)。
（3）拆下電泳裝置，取出聚丙烯酰胺凝膠，放到一個(gè)塑料盤(pán)內，用蒸餾水沖洗1~2遍。
（4）倒入固定液，固定 8~10分鐘。
（5）用蒸餾水沖洗1~2遍；倒入銀染液，銀染10~12分鐘。
（6）用蒸餾水沖洗若干遍；倒入顯色液，顯色至出現清晰的銀染帶。
（7）用蒸餾水浸泡聚丙烯酰胺凝膠，觀(guān)察PCR-SSCP結果。
