PCR技術(shù)大攻略
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發(fā)布時(shí)間：2016-09-21
一、PCR技術(shù)及步驟
聚合酶鏈式反應（PCR）
PCR擴增產(chǎn)物的克隆
上述兩個(gè)實(shí)驗包含基本原理、步驟、問(wèn)題等。
二、PCR常見(jiàn)問(wèn)題匯總
1. 沒(méi)有得到擴增產(chǎn)物
（1）酶失活或在反應體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過(guò)更換新酶或用另一來(lái)源的酶以獲得滿(mǎn)意的結果。
（2）模板含有雜質(zhì)。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結果。
（3）變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度是否相符，過(guò)高酶在前幾個(gè)循環(huán)就迅速失活；過(guò)低則模板變性不徹底。
（4）反應系統中污染了蛋白酶及核酸酶，應在未加Taq酶以前，將反應體系95℃加熱5-10分鐘。
（5）引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲存條件不當而失活。
（6）使用PCR試劑盒時(shí)還應注意：
①是否嚴格按照說(shuō)明書(shū)操作；
②試劑使用前是否充分混勻；
③試劑儲存過(guò)久或不當而失效。
2. 擴增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀
（1）酶量過(guò)高。減少酶量；酶的質(zhì)量差，調換另一來(lái)源的酶。
（2）dNTP濃度過(guò)高。減少dNTP的濃度。
（3）MgCl2濃度過(guò)高?？蛇m當降低其用量。
（4）循環(huán)次數過(guò)多；增加模板量減少循環(huán)次數，縮短退火時(shí)間及延伸時(shí)間，或改用二種溫度的PCR循環(huán)。
（5）退火溫度過(guò)低。
（6）電泳體系有問(wèn)題：
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；
②凝膠沒(méi)有凝固好；
③瓊脂糖質(zhì)量差。
（7）若為PCR試劑盒則可能：
①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效；
②試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題，如引物選擇、循環(huán)參數等選擇不當。
（8）降解的陳舊模板擴增也易產(chǎn)生涂布。
3. 溴酚藍前有區帶（很寬）
（1）模板量太低。增加模板DNA的用量。
（2）循環(huán)次數太多。減少循環(huán)次數。
（3）復性度偏低。提高復性溫度。
（4）預變性后沒(méi)有立刻上機循環(huán)。
（5）引物3'端是否互補；重新設計合成較長(cháng)的引物。
（6）引物用量偏多。降低引物的使用量。
4. 擴增產(chǎn)物出現多條帶
（1）引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。
（2）循環(huán)的次數過(guò)多。適當增加模板的量，減少循環(huán)次數。
（3）酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應降低酶量或調換另一來(lái)源的酶。
（4）退火溫度偏低，退火及延伸時(shí)間偏長(cháng)。應提高退火溫度，減少變性與延伸時(shí)間，也可采用二種溫度的PCR擴增。
（5）樣品處理不當。
（6）Mg2+濃度偏高，因適當調整Mg2+使用濃度。
（7）若為PCR試劑盒，也可能時(shí)試劑盒本身質(zhì)量有問(wèn)題。
